[发明专利]与布氏杆菌毒力相关的基因及其在布氏杆菌毒力评价及制备弱毒布氏杆菌中的应用

说明书

本发明公开了一种与布氏杆菌毒力相关的基因及其在布氏杆菌毒力评价及制备弱毒布氏杆菌中的应用。本发明首先利用蛋白结构域及3D结构预测鉴定到一种与布氏杆菌毒力相关的基因——abcS基因。利用RecA同源重组的方法，以卡那霉素抗性基因作为筛选标记替换abcS基因，构建了布氏杆菌abcS基因缺失株M28ΔabcS。荧光定量PCR试验表明，M28ΔabcS突变株中毒力因子四型分泌系统的表达严重下降。利用Balb/c小鼠持留感染模型评价了布氏杆菌abcS基因对布氏杆菌M28毒力的影响。结果显示：abcS基因缺失显著降低感染时脾脏的肿胀，同时严重影响细菌在小鼠脾脏内复制存活的能力，证实该基因是布氏杆菌M28的毒力相关基因。本发明的提出为布氏杆菌疫苗和药品的研发，提供了新的技术手段。

技术领域

本发明涉及布氏杆菌的一种新型毒力基因，还涉及该毒力基因在布氏杆菌毒力评价以及制备弱毒布氏杆菌中的应用。本发明属于生物技术领域。

背景技术

布氏杆菌病是目前我国流行最严重的人兽共患细菌病之一。动物布氏杆菌病通常会导致牲畜附睾炎和流产相关的生殖障碍。在人类中，布氏杆菌病的症状是体虚、波状热和各种器官的慢性炎症，包括脾脏、肝脏、骨骼和其他器官。布氏杆菌病的病原为布氏杆菌，是一种革兰氏阴性胞内寄生菌。在已确认的10种布氏杆菌中，羊种布氏杆菌对人类的致病性最强。布氏杆菌进入人体通常是通过吸入或食用受污染的肉类或奶制品。一旦进入，它们可以穿透粘膜表面，并通过巨噬细胞进一步传递到淋巴结。布氏杆菌具有在巨噬细胞内存活和复制的能力，除了巨噬细胞外，布氏杆菌还可以感染多种宿主细胞，例如上皮细胞和生殖组织细胞。布氏杆菌已知的毒力因子包括脂多糖(LPS)和四型分泌系统(T4SS，VirB1-VirB12)，它们帮助细菌逃避或抑制宿主免疫系统，来保证布氏杆菌在宿主体内的存活。然而，目前对布氏杆菌新的毒力因子的了解是非常有限的，大大限制了国内现有布病疫苗的创制、优化能力。已有的动物用减毒活疫苗可能存在残余毒力并对动物及人致病。因此，布氏杆菌新毒力因子的鉴定，有着非常重要的理论和实践意义。

Extracytoplasmic function sigma factor(ECF)系统广泛存在于细菌中，通常包括2个结构蛋白组分，即sigma(bcrS)和anti-sigma(abcS)。Sigma因子通常被抑制因子abcS所束缚，当感应到外界环境响应信号时，通过各种蛋白酶的作用将抑制因子abcS分解并且释放出sigma因子，表达相关的基因。在这个过程中，abcS主要作为感应信号和控制sigma释放的开关，在我们的研究中发现这个ECF系统中bcrS对于布氏杆菌毒力未产生明显影响，而抑制因子abcS却明显影响强毒株M28致病力。

本发明首次证明布氏杆菌sigma因子抑制因子abcS参与布氏杆菌毒力，对于布氏杆菌相关疫苗的研发具有潜在的应用价值。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种新型的与布氏杆菌毒力相关的基因及其用途。

本发明的目的之二在于提供一种布氏杆菌毒力基因检测试剂盒。

本发明的目的之三在于提供一种致弱的布氏杆菌及其构建方法。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明首先利用蛋白结构域及3D结构预测鉴定到布氏杆菌M28菌株Anti-sigma因子B0023，命名为AbcS。利用基于RecA同源重组的方法，以卡那霉素抗性基因作为筛选标记替换布氏杆菌M28菌株的abcS基因，构建了布氏杆菌abcS基因缺失株M28ΔabcS。荧光定量PCR试验表明，M28ΔabcS突变株中毒力因子四型分泌系统的表达严重下降。利用Balb/c小鼠持留感染模型评价了布氏杆菌abcS基因对布氏杆菌M28毒力的影响。结果显示：abcS基因缺失显著降低感染时脾脏的肿胀，同时严重影响细菌在小鼠脾脏内复制存活的能力，证实该基因是布氏杆菌M28的毒力相关基因。