[发明专利]与布氏杆菌毒力相关的基因及其在布氏杆菌毒力评价及制备弱毒布氏杆菌中的应用

权利要求书

1.与布氏杆菌毒力相关的基因在布氏杆菌毒力评价中的应用，所述的应用不包括以疾病的诊断和治疗为目的的布氏杆菌毒力评价，所述的基因为编码布氏杆菌sigma因子抑制因子anti-sigma(abcS)的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.与布氏杆菌毒力相关的基因在制备弱毒布氏杆菌中的应用，所述的应用不以疾病的诊断和治疗为目的，所述的基因为编码布氏杆菌sigma因子抑制因子anti-sigma(abcS)的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.一种致弱的布氏杆菌，其特征在于，所述的布氏杆菌的基因组中不含编码布氏杆菌sigma因子抑制因子abcS的基因。

4.如权利要求3所述的致弱的布氏杆菌，其特征在于，通过以下方法制备得到：

(1)合成用于构建布氏杆菌abcS基因缺失株的引物：

abcS_up-F:

5’CAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCTTTCATGGCGTCGCCT3’

abcS_up-R:5’GTTCTTCTGACTTCAGCTCGCCCGTCAGG3’

abcS_kan-F:

5’CGAGCTGAAGTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGC3’

abcS_kan-R:

5’CTTCTTCCCCGCGATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGA3’

abcS_down-F:5’TTTGAATCGCGGGGAAGAAGCGCG3’

abcS_down-R:5’TCTGATATCATCGATGAATTCAAGACCAGTAAATA GAGAAATATGACCAG3’

CK-abcS-F1:5’CCCATGATCGTGCTTCTC3’

CK-abcS-R1:5’GTGCGATCTTCAGCGGTTC3’

Km-1:5’CAGTCATAGCCGAATAGCCT3’

Km-2:5’CGGTGCCCTGAATGAACTGC3’

CK-abcS-F2:5’ATGCAGAGGCTGCTATTG3’

CK-abcS-R2:5’ACGCCTGTTCCCACAATG3’

SP6-F:5’ATTTAGGTGACACTATAGAA3’

T7-R:5’TAATACGACTCACTATAGGG3’

(2)基因缺失质粒的构建

以布氏杆菌基因组DNA为模板，使用引物abcS_up-F、abcS_up-R和abcS_down-F、abcS_down-R分别PCR扩增abcS基因上游与下游同源臂；以pBlue-Kan为模板，使用引物abcS_kan-F和abcS_kan-R扩增卡那霉素抗性基因(Kanr)表达盒，切胶回收以上三段目的片段；用BamHI和EcoRI双酶切pSP72载体，将酶切后的载体片段与上述三段目的片段进行连接，连接产物转化至感受态细胞中，涂布卡那霉素抗性平板，筛选阳性克隆，得到的阳性克隆命名为pSP72-abcS-km；

(3)基因缺失质粒的电击转化及abcS基因缺失株的鉴定筛选

将pSP72-abcS-km电转化至布氏杆菌感受态细胞中，筛选获得具有卡那霉素抗性而无氨苄青霉素抗性的阳性克隆，对筛选到的候选缺失株通过平板划线传代检测其稳定性，利用CK-abcS-F1+km-1、km-2+CK-abcS-R和CK-abcS-F2+CK-abcS-R2三对引物进行PCR鉴定，最后辅以测序鉴定，选取阳性菌株扩大培养后保存，得到致弱的布氏杆菌。

5.如权利要求4所述的致弱的布氏杆菌，其特征在于，所述的布氏杆菌为布氏杆菌M28，构建得到的致弱的布氏杆菌命名为M28ΔabcS。