[发明专利]一种经济实用的核酸链5’-羟基磷酸化方法

说明书

本发明公开一种核酸链上5’‑羟基磷酸化的经济型方法：该方法以购买的非修饰的DNA短片段为原料，其5’‑端为羟基，以商业购买的10倍磷酸化缓冲液成分为磷酸源，在T4多聚核苷酸激酶作用下将DNA的5’‑羟基磷酸化。本发明所提供的方法，适用范围广，反应条件温和，后处理简单，回收率高，成本低，应用前景广泛。

技术领域

本发明属于生物化学领域，具体涉及一种经济实用的核酸链5’-羟基磷酸化方法。

背景技术

任何一种药物的开发都是一个漫长和耗资巨大的过程。据药物研发的统计资料报道，一种新药从开始研发到最终批准投放市场，平均需6～10年的时间，研究费用更是高达10～30亿美元。药物的研制历程之所以这样漫长，费用高昂，其中很重要的一个原因是先导化合物的发现与优化过程缓慢^[i]。为了解决这一难题，DNA编码化合物库技术(DNA-encodedlibrary technology，简称DELT)应运而生。这一概念最早由美国Scripps研究院的SydneyBrenner(2002年诺贝尔生理与医学奖获得者)和Richard Lerner(时任Scripps研究所所长)^[ii]于1992年提出。在新型药物的研发过程中，科学家们不断地寻求多样性的筛选方法以便在许多化合物中，对生物学靶标的结合亲和力和/或药理学效力以无差异性的筛选方式找到优异的活性化合物。高度自动化以及深度优化后的多种高通量筛选在活性化合物的筛选与发现中的积极影响是无可争议的。在高通量筛选中，伴随着自动化技术优化和筛选流程的完善，化学分子库质量的提升和化合物数量的增长，国际上主流的药物研发公司常常依赖这种方法来获得目标蛋白的先导化合物。但是，高成本导致了化学结构及化合物总数上的局限性，越来越不能满足新药研发的需求。在很多疾病蛋白的筛选实践中用这种传统方法是徒劳无功的。为了能突破高通量筛选方法的瓶颈，使筛选化合物在化学结构空间及数量上能呈现几何级数上的飞跃，以及使用一种全新的生物筛选方式，DELT恰好应运而生。

与传统高通量筛选相比，DNA编码化合物库极大地丰富了化合物数量和多样性^[iii]。在很小体积例如几十微升的反应管中，通过一系列反应后，可以合成上千万甚至上亿种不同的化合物^[iv]。DELT的原理是用一段特异的DNA序列来标记反应过程中的每一个小分子化合物，用组合化学的策略，通过使用拆分、合并(split and pool)的方法，利用有限的成本和时间，大量合成百万级至百亿级连接有特定DNA序列的化合物文库^[v]。然后将所得化合物的混合物与蛋白质靶标一起孵育，通过洗去没有与蛋白质靶标结合的化合物而达到物理分离并找到具有高结合亲和力的化合物^[vi]。因为孵化靶标蛋白质所需的DNA编码化合物库只需极其小的剂量规模(微克)而且可以在很短时间内进行，这样就可以轻松地在不同条件下^[vii]进行多项筛选实验(例如，溶液的酸碱度，样品蛋白混合方式，蛋白质浓度变化，存在或不存在竞争剂化合物的情况下，存在不同的缓冲液或辅助因子的情形下)。由于DNA序列与化合物一一对应，只需将小分子化合物的DNA序列通过PCR扩增和NGS测序读取后，就可以得到活性化合物的化学结构式。然后对具有高亲和力化合物进行“脱离DNA”的单独合成，即不用DNA序列标记化合物，测定没有附着DNA的化合物与目标蛋白质的结合力以确认其真实的生物活性。