[发明专利]一种经济实用的核酸链5’-羟基磷酸化方法

权利要求书

1.一种将核酸链的5’-羟基磷酸化的方法，其特征在于在反应混合物中添加ATP和/或PEG，其中所述反应混合物中包括：核酸链、T4多聚核苷酸激酶、磷酸化缓冲液；

优选地，所述核酸链为寡核苷酸链；更优选地，所述核酸链为DNA寡核苷酸链；更优选地，所述核酸链为未磷酸化的DNA寡核苷酸链；

优选地，所述反应是在去核酸酶水或去核酸酶水溶液中进行。

2.根据权利要求1的方法，其中所述PEG的量为每纳摩尔核酸链中加入0-0.04微升PEG，优选，0.01-0.04微升PEG，优选0.025微升PEG；

优选地，所述PEG选自PEG 100到PEG 8000；更优选地，所述PEG为PEG 4000。

3.根据权利要求1或2的方法，其中所述ATP的量为每纳摩尔核酸链中加入0-5纳摩尔ATP，优选1-5纳摩尔ATP，优选2.5纳摩尔ATP。

4.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中所述核酸链为DNA寡核苷酸链；更优选地，所述DNA寡核苷酸链为单链；更优选地，所述DNA寡核苷酸链的5’-端为羟基；更优选地，所述DNA寡核苷酸链由正常核苷酸单体聚合制备，和/或是由人工修饰后的核苷酸单体聚合制备。

5.根据权利要求1-4中任一项的方法，其中所述T4多聚核苷酸激酶的量为每纳摩尔核酸链中加入0-0.50单位T4多聚核苷酸激酶，优选0.25单位T4多聚核苷酸激酶。

6.根据权利要求1-5中任一项的方法，其中每10纳摩尔核酸链的反应体系为25毫升。

7.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述去核酸酶水为不含核酸酶的水；或者

所述去核酸酶水溶液为含乙腈，乙醇，二甲基亚砜，二甲基甲酰胺，二甲基乙酰胺，无机盐缓冲液中的任意一种或几种的含水且不含核酸酶的混合溶剂。

8.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述磷酸化缓冲液成分为10倍磷酸化缓冲液成分，其包含500毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，100毫摩尔/升氯化镁，100毫摩尔/升二硫代苏糖醇，10毫摩尔/升ATP；

优选地，所述磷酸化缓冲液的量为每纳摩尔核酸链中加入0-80微升，优选1微升。

9.根据前述权利要求中任一项的方法，其中反应温度为0℃到50℃，优选37℃；

优选地，反应时间为0小时-24小时；更优选地，反应时间为0.5小时。

10.一种用于将核酸链的5’-羟基磷酸化的试剂盒，其包含T4多聚核苷酸激酶、磷酸化缓冲液、ATP和/或PEG；

优选地，所述磷酸化缓冲液包含500毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，100毫摩尔/升氯化镁，100毫摩尔/升二硫代苏糖醇，10毫摩尔/升ATP，25℃下pH值为7.5；

优选地，所述PEG为PEG 4000。

11.一种用于将核酸链的5’-羟基磷酸化的组合物，其包含T4多聚核苷酸激酶、磷酸化缓冲液、ATP和/或PEG；

优选地，所述组合物包含0.01-0.04微升PEG/纳摩尔核酸链和/或1-5纳摩尔ATP/纳摩尔核酸链，0.05-0.25单位T4多聚核苷酸激酶/纳摩尔核酸链，0.1-80微升磷酸化缓冲液/纳摩尔核酸链；

优选地，所述组合物包含0.025微升PEG/纳摩尔核酸链和/或2.5纳摩尔ATP/纳摩尔核酸链，0.25单位T4多聚核苷酸激酶/纳摩尔核酸链，1微升磷酸化缓冲液/纳摩尔核酸链；

优选地，所述磷酸化缓冲液包含500毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，100毫摩尔/升氯化镁，100毫摩尔/升二硫代苏糖醇，10毫摩尔/升ATP。

12.一种用于将核酸链的5’-羟基磷酸化的方法，包括将根据权利要求11的组合物与核酸链混合并反应。