[发明专利]一种用于检测12种儿童消化道感染相关细菌的引物探针组合及试剂盒

说明书

本发明涉及一种用于同步检测多种儿童常见消化道感染相关细菌的引物组、探针组及包含这些的试剂盒，所述引物组、探针组及试剂盒可实现一次反应同时检测多种引起消化系统感染的常见细菌，是目前最全面的儿童消化道细菌感染检测方法，效率高、特异性强，为临床检验提供辅助诊断的依据。通过本技术方案的公开，可以缓解现有技术中存在的对儿童消化道感染相关的细菌类病原菌诊断研究尚有不足的技术问题。

技术领域

本发明属于病原微生物分子生物学领域，具体涉及一种用于儿童消化道感染细菌类病原菌系列检测和区分的引物探针组合及试剂盒。

背景技术

消化道感染是一种常见疾病，在临床儿科中尤为多见，发病率呈逐年增高趋势，仅次于呼吸系统感染，位列儿科第二大多发病，多因细菌、病毒、真菌或寄生虫等病原菌感染导致。全年均可发病，细菌中常见的是空肠弯曲杆菌（CJE）、艰难梭菌（Cdiff）、鼠伤寒沙门菌（STYP）、副溶血性弧菌（VP）、小肠结肠炎耶尔森菌（Yent）、黏附性大肠埃希菌（EAEC）、产毒性大肠埃希菌（ETEC）、致病性大肠埃希菌（EPEC）、出血性大肠埃希菌（EHEC）、侵袭性大肠埃希菌（EIEC）、志贺菌(SD)、霍乱弧菌（Vc）。

消化道感染引起的病症是感染性腹泻，如细菌性痢疾，主要由志贺菌属引起，中毒性痢疾常见于小儿；沙门菌属、大肠埃希菌等可引起爆发和集体发病为特征的细菌性食物中毒，严重者可危及生命。由此可见，这些消化道细菌大都具有感染力强、发病急、潜伏期短等特点，是造成儿童致死致残的重要原因。随着社会进步，越来越多的新的致病性消化道细菌被发现，给临床相关疾病的诊断和治疗造成极大的困难。

此外，消化道感染还会导致患儿营养不良，进而影响患儿的正常生长发育，在发展中国家此类影响尤为明显。因此，消化道病原菌的感染和流行问题已引起世界各国的密切关注和高度重视。

及时准确地判断出消化道感染病原菌的种类，对于传染源的早期发现、流行病的控制及临床治疗的有效开展均具有重要意义。

多年来，世界各地的医院及实验室均常规使用镜检法、病原菌分离培养、免疫学检查等方法对消化道常见病原菌进行检测，但这些检测方法都存在许多难以克服的缺陷。

直接镜检法准确性差、安全性存在明显不足；传统的病原菌分离方法操作步骤繁琐，条件要求较高，检测周期长，实验安全性和结果准确性相对难以保证；消化道感染病原菌免疫学检测法常采用酶联免疫吸附试验，该法具有直观、技术成熟、特异性好的优点，但耗时、操作繁琐、灵敏度低、假阳性高等限制了其在临床上的参考价值。

近年来，分子生物学技术如实时荧光PCR技术等的引入，很大程度上改善了检测和鉴定病原菌的现状。普通荧光PCR检测具有较好的灵敏度和特异性，提高了临床鉴定水平，但实际应用过程中该技术多是针对单项或几项病原菌，想要同步检测多种病原菌就需要多种检测试剂盒搭配，操作不便且成本较高。针对消化道感染病原菌的特点，建立起高效、快速、简便、特异的检测方法，以适应疫情筛查和临床检测的需求，是当前消化道感染性疾病防治工作的重点，因而多重荧光定量PCR技术应运而生。

多重荧光定量PCR是在实时荧光定量PCR技术基础上发展出的多重联检，能够在同一个反应管中实现多个基因序列的扩增和特异性检测。在临床病原菌检测的应用中，可同步检测同一标本内几十种乃至上百种关联病原菌，有利于精确判断病情，实现疾病的早期、快速、精准治疗。多重PCR技术的成功实施需要解决以下几个关键技术问题：（1）由于需要使用多组引物/探针组合，设计时需要避免不同引物/探针之间互相产生交联。（2）避免每组引物/探针对其他目标和非目标核酸序列有交叉同源性，以防止产生假阳性结果。（3）每种扩增子的最佳扩增条件不同，需要优化反应条件，保证在单一扩增条件下各扩增子都能成功扩增。（4）需要有内对照作为参考以排除来自核酸提取等方面的干扰。

目前还没有可对以上儿童多种消化道感染细菌类病原菌进行同步PCR法检测的产品，并保证检测准确性和特异性的有效方法。本发明将是市面上最全面的儿童消化道感染细菌类病原菌检测产品。

发明内容