[发明专利]一种基于人造新冠病毒孵化细胞的灭活疫苗制备方法

说明书

一种基于人造新冠病毒孵化细胞的灭活疫苗制备方法，根据新冠病毒通过ACE2受体感染宿主细胞并易在表达ACE2的宿主细胞中繁殖的机制，从产前诊断后废弃的细胞中分离肺干细胞，转染ACE2和SV40LT基因，开发易使新冠病毒进入细胞内繁殖的永生化新冠病毒孵化细胞，使病毒与孵化细胞共培养时能随孵化细胞的扩增而大量繁殖，孵化所得病毒液经滤器过滤、超滤浓缩、层析纯化、除菌过滤、甲醛灭活、纯度检测、中和抗体及残留蛋白和DNA检测合格后，制成灭活疫苗。本发明不使用异种动物或细胞扩增病毒而是以同种人类永生干细胞制备的孵化细胞扩增新冠病毒，使所制新冠疫苗不会残留具有免疫原或致瘤等风险的异种动物蛋白或基因片段，疫苗接种理论上较安全。

技术领域

本发明涉及一种基于人造新冠病毒孵化细胞的灭活疫苗制备方法，属于生物医学领域的传染病防治技术。

背景技术

在新冠病毒病(COVID-19)的防控、治疗或研究中，通常需要大量的新冠病毒作为科研材料，所以需要一种可以大规模培养新冠病毒的基质或方法，以获得所需新冠病毒。

在常用的病毒培养方法中，鸡胚培养技术比组织培养容易成功，也比组织培养方法中的动物来源容易，培养过程中无饲养管理及隔离等的特殊要求，而且鸡胚相对无病毒隐性感染，对于生产企业而言，它的敏感范围很广，能适应多种病毒，因此，是目前比较常用的一种培养动物病毒的方法。鸡胚培养法是将病毒接种于鸡胚中进行病毒培养的一种方法，该方法适用于某些对鸡胚敏感的动物病毒，近年来随着细胞培养技术和组织培养技术的迅速发展，使得鸡胚培养技术在某些方面已被其他技术所取代。

WHO于1982年批准以1962年建立的非洲绿猴肾细胞系(Vero细胞)作为基质细胞培养病毒，用于狂犬病疫苗、轮状病毒疫苗、流行性乙型脑炎病毒疫苗、流感病毒疫苗、肠道病毒71型疫苗等病毒疫苗的研究和生产。WHO同时也规定在用Vero细胞生产的疫苗产品中Vero细胞残余DNA含量不能超过100pg/剂，因为Vero细胞本质为猴肾细胞系，用Vero细胞生产的疫苗产品中可能残留的Vero细胞成分对人类来说是异种物质，如果超标就可能会影响疫苗的安全性。如美国食品药品监督管理局(FDA)报道，制备流感疫苗的基质细胞(MDCK细胞)残留的大于200bp的基因片段可能具有致癌作用。所以，如果以人细胞系作为基质细胞制备新冠病毒，进而制备灭活病毒疫苗，所残留的基质细胞成分应该影响更少。

文献报道，人间充质干细胞在体外传代至15-30代就会出现衰老或死亡，其他组织细胞的传代时间更短，而经猿猴病毒40大T抗原基因(SV40LT)和/或人端粒酶逆转录酶(hTERT)转染的细胞系可在体外培养350代以上，并能基本保留原始细胞的分化表型和生物学特性，已广泛应用于人源性肝细胞、血管纹边缘细胞、软骨干细胞等的永生化。这为将人类羊水干细胞或肺组织细胞改造为可用于大规模培养病毒的永生化干细胞系提供了依据。

文献报道，SARS-CoV能在血管紧张素转换酶2(ACE2)基因转染的293T细胞中复制，但不能在模拟转染(不含ACE2)的293T细胞中复制，SARS-CoV-2也与SARS-CoV一样，通过ACE2受体感染细胞。SARS-CoV-2含有刺突蛋白(S)、膜蛋白(M)、包膜蛋白(E)和核壳蛋白(N)，其中S蛋白包括N端的S1亚基和C端的S2亚基，S1亚基由N端的结构域(S1-NTD)和受体结合域(S1-RBD)组成，S1-RBD负责识别并结合细胞表面受体血管紧张素转换酶2(ACE2)，S2亚基介导病毒包膜和细胞膜融合，使病毒通过受体ACE2进入细胞从而引起感染。所以不管人体细胞对新冠病毒是否易感，均可通过慢病毒转染的方法将ACE2整合到永生化干细胞系DNA上进行表达，以增强干细胞系对新冠病毒的易感性或使易感性由弱变强，制备成新冠病毒孵化细胞，使新冠病毒更易进入这种过表达ACE2的永生化的新冠病毒孵化细胞内繁殖，以用于产业化制备新冠病毒，用于新冠病毒灭活疫苗的制备以及其他相关应用。

发明内容

为了解决上述问题，本发明人提出了本发明。

本发明的目的是要公开一种人造新冠病毒孵化细胞的方法以及基于人造新冠病毒孵化细胞的新冠肺炎灭活疫苗制备方法。