[发明专利]一种基于人造新冠病毒孵化细胞的灭活疫苗制备方法

权利要求书

1.一种基于人造新冠病毒孵化细胞的灭活疫苗制备方法，其特征在于，根据新冠病毒通过ACE2受体感染宿主细胞并易在表达ACE2的宿主细胞中繁殖以及SV40LTAg可使人类成纤维细胞永生化的机制，通过基因转染将ACE2和SV40LTAg整合到源自产前诊断后剩余胎儿细胞的干细胞DNA上，开发出因过表达ACE2和SV40LTAg而易使新冠病毒进入细胞内繁殖的永生化新冠病毒孵化细胞，使新冠病毒与所述孵化细胞在含有3～5g/L微载体的DMEM培养液的生物反应器内并在37℃、5％CO₂、pH值7.2、搅拌速度为50±20rpm的条件下共同培养时能随孵化细胞的无限扩增而大量繁殖，然后收集含有大量繁殖病毒的培养物，进行75μm、0.45μm和0.22μm滤器过滤、100KD超滤膜超滤浓缩、Sepharose CL-6B凝胶过滤层析纯化、0.22μm滤器除菌过滤、92.5μg/ml甲醛灭活、灭活效果验证、病毒液纯度检测、中和抗体检测、病毒液蛋白和DNA残留量检测以及动物试验合格后产业化制备成新冠病毒灭活疫苗。

2.根据权利要求1所述的一种基于人造新冠病毒孵化细胞的灭活疫苗制备方法，其特征在于，所述SV40LTAg使人类成纤维细胞永生化包括以hRERT制备永生化新冠病毒孵化细胞。

3.根据权利要求1所述的一种基于人造新冠病毒孵化细胞的灭活疫苗制备方法，其特征在于，所述干细胞包括源自临床或实验的脐血、脐带、胎盘、肺组织细胞及间充质细胞。

4.根据权利要求1所述的一种基于人造新冠病毒孵化细胞的灭活疫苗制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)采集产前诊断后剩余羊水细胞，分离梭形羊水细胞或肺组织细胞，转染SV40LT和/或hTERT基因，以G418和/或嘌呤霉素筛选永生化细胞系，经细胞系生物学鉴定、肺干细胞标志物检测获得永生化羊水间充质干细胞系或肺干细胞系，表达为MSC-SV40LT/hTERT。

(2)将ACE2基因连接到慢病毒表达载体即pHBLV-CMV-ACE2-EF1-ZsGreen-T2A-puro或pGC-FU中，构建重组质粒pHBLV-OE-ACE2或pGC-FU-ACE2，然后将pHBLV-OE-ACE2和包装质粒psPAX2、pMD2G或将pGC-FU-ACE2和包装质粒pHelper1.0、pHelper2.0分别共转染293FT细胞，包装携带ACE2的重组慢病毒Lentiviral-ACE，再将重组慢病毒转染MSC-SV40LT/hTERT，使ACE2整合到永生化干细胞DNA上，经过筛选和鉴定，获得易使新冠病毒感染和繁殖的永生化新冠病毒孵化细胞，作为制备新冠病毒灭活疫苗的基质细胞，表达为NCIC细胞。

(3)将永生化新冠病毒孵化细胞(NCIC细胞)分装于安瓶内，标明组织来源和分型，每个安瓶10×10⁶个细胞，收藏于-196℃液氮的新冠病毒孵化细胞库中。

(4)取细胞库中的孵化细胞，经传代培养至所需细胞量时转种到含有3～5g/L微载体的DMEM细胞培养液的生物反应器中，在37℃、5％CO₂、pH值7.2、搅拌速度50±20rpm的条件下培养，使细胞在悬浮于培养基中的微载体表面粘附生长成60％汇合度，然后换上病毒维持液，接种0.01～0.3MOI量的新冠病毒液，在33℃、5％CO₂、pH值7.4、搅拌速度为50±20rpm的条件下培养48～96小时，至孵化细胞完全病变时收获病毒液。

(5)病毒液经75μm、0.45μm和0.22μm滤器过滤、100KD超滤膜超滤浓缩、Sepharose CL-6B凝胶过滤层析纯化、0.22μm滤器除菌过滤、92.5μg/ml甲醛灭活、灭活效果验证、病毒液纯度检测、中和抗体检测以及病毒液蛋白和DNA残留量检测合格并经进一步临床试验后，制成所需的新冠病毒灭活疫苗。