[发明专利]一种测定新鲜烟叶中氨基酸含量的方法

说明书

本发明公开了一种测定新鲜烟叶中氨基酸含量的方法，包括如下步骤：①配制18种氨基酸的标准溶液；②样品处理：③高效液相色谱分析；④计算求得样品中的各氨基酸的含量。本发明的方法简单，适用于新鲜烟叶中18种游离氨基酸的含量分析。

技术领域

本发明属于烟草技术领域，具体涉及一种自动衍生高效液相色谱法测定新鲜烟叶中氨基酸含量的方法。

背景技术

氨基酸是烟草中一类重要化合物，在烟草生长、调制、醇化、加工直至成品卷烟抽吸过程中，氨基酸与烟草中的还原糖发生非酶棕化反应，生成多种香味前体物质，某些氨基酸如苯丙氨基酸还可以自身分解成香味化合物，对形成优美的烟草香气和吸味有重要贡献。因此分析烟草中氨基酸含量，对烟草品质评价及卷烟配方设计等均有重要意义。

烟草氨基酸的分析方法有直接测定法和间接测定法，直接测定法有离子色谱-脉冲安培检测法和液相色谱-串联质谱法。间接测定法有柱前衍生和柱后衍生法。柱后衍生稳定好，行业标准YC/T 282-2009即采用柱后衍生法，但柱后衍生法需要专用的衍生设备，分析耗时，且仪器用途单一；柱前衍生则无需专用的反应装置，使用更为灵活广泛。测定烟草氨基酸的柱前衍生法主要有邻苯二醛(OPA)法、6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯(AQC)法、4-硝基苯甲酰氯法。OPA法操作简便，但无法测定二级氨基酸；AQC法能同时与一级和二级氨基酸迅速反应，但操作过于繁琐；4-硝基苯甲酰氯法也能同时测定一级和二级氨基酸，但色谱分离困难，必须使用液相色谱串联质谱的多反应监测模式分析，对仪器配置要求很高。

异硫氰酸苯酯(PITC)法分析氨基酸具有反应快速、产物单一稳定、操作相对简单、与一级、二级氨基均可反应等特点，已应用于食品、中药材、饲料等领域氨基酸的分析。但因为氨基酸成分多，极性相近，分离比较困难，因此一些专业公司开发了配套的专用色谱柱，如SMA氨基酸色谱柱、Venusil AA氨基酸色谱柱、Ultimate Amino Acid氨基酸色谱柱等，这些氨基酸色谱柱价格相对较高，色谱条件相对苛刻。

为解决上述问题提出本发明。

发明内容

本研究采用异硫氰酸苯酯(PITC)为衍生试剂、使用自动样品处理台自动柱前衍生、常规液相色谱柱分离，建立了新鲜烟叶中18游离氨基酸的分析方法，以期为烟草品质评价和代谢研究提供技术支持。

本发明的技术方案如下：

一种测定新鲜烟叶中氨基酸含量的方法，包括如下步骤：

①配制18种氨基酸的标准溶液；

②样品处理：称取一定量冻干的新鲜烟叶粉末加入水中超声提取、过滤，得到的滤液进一步处理后用于分析；

③高效液相色谱分析：分析条件为：色谱柱：Waters SunFire C18，规格：4.6×150mm，5μm；流动相：A为0.1mol/L乙酸钠水溶液、pH 6.50，B为80％(V/V)乙腈；洗脱程序：0-5min，100％A；5-13.5min，100％-94％A；13.5-18min，94％-84％A；18-25min，84％-72％A；25-28min，72％-0A；28-32min，0A；32-33min，0-100％；33-40min，100％。流速：1mL/min；柱温：40℃；进样量：10μL；检测波长：254nm；

④计算：采用外标法进行定量分析，即以步骤①的18种氨基酸不同浓度对应峰面积进行回归分析，得到标准曲线，使得相关系数不小于0.99；对步骤②进一步处理后的滤液进行测定，测得各氨基酸的峰面积，代入标准曲线求得样品中的各氨基酸的含量。