[发明专利]一种测定新鲜烟叶中氨基酸含量的方法

权利要求书

1.一种测定新鲜烟叶中氨基酸含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：

①配制18种氨基酸的标准溶液；

②样品处理：称取一定量冻干的新鲜烟叶粉末加入水中超声提取、过滤，得到的滤液进一步处理后用于分析；

③高效液相色谱分析：分析条件为：色谱柱：Waters SunFire C18，规格：4.6×150mm，5μm；流动相：A为0.1mol/L乙酸钠水溶液、pH 6.50，B为80％(V/V)乙腈；洗脱程序：0-5min，100％A；5-13.5min，100％-94％A；13.5-18min，94％-84％A；18-25min，84％-72％A；25-28min，72％-0A；28-32min，0A；32-33min，0-100％；33-40min，100％。流速：1mL/min；柱温：40℃；进样量：10μL；检测波长：254nm；

④计算：采用外标法进行定量分析，即以步骤①的18种氨基酸不同浓度对应峰面积进行回归分析，得到标准曲线，使得相关系数不小于0.99；对步骤②进一步处理后的滤液进行测定，测得各氨基酸的峰面积，代入标准曲线求得样品中的各氨基酸的含量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤①中18种氨基酸分别为丙氨酸、天冬氨酸、精氨酸、胱氨酸、甘氨酸、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，18种氨基酸的标准溶液的配制步骤为：分别称取18种氨基酸标准物质0.025g至25mL容量瓶中，精确至0.0001g，用0.01mol/L的HCl定容，配制成浓度为1000μg/mL的单一标准储备液；然后移取每种单一标准储备液各1mL至10mL容量瓶中，用0.01mol/L的HCl定容，得到每种氨基酸浓度为100μg/mL的混合储备液，4℃保存备用。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤②中样品处理的步骤为：准确称取粉碎后的冻干烟叶粉末0.2g于15mL离心管中，加入5mL水超声提取30min后过滤得到滤液；准确移取0.5mL得到的滤液于5mL离心管中，分别加入14％三乙胺-乙腈溶液和1.2％异硫氰酸苯酯-乙腈溶液各0.5mL，混匀，室温静置30min后，加入1mL正己烷，旋涡振荡60s后，8000r/min高速离心5min，取上层清液用水稀释5倍，经0.45μm有机滤膜过滤后上机分析。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤④的18种标准氨基酸的定量限为0.03～0.10mg/g；每个浓度3次进样、平均校正，得到18种氨基酸的线性范围介于2～50μg/mL，相关系数不小于0.99。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤④的样品其中的天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸和赖氨酸按0.05、0.10、0.20mg/g的3个水平添加；其中的精氨酸、胱氨酸、谷氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸和酪氨酸按0.10、0.20、0.40mg/g的3个水平添加；每个水平重复6次。