[发明专利]一种结核菌素纯蛋白衍生物的生产方法

说明书

本发明公开了一种结核菌素纯蛋白衍生物的生产方法，属于生物蛋白制备技术领域。以结核分枝杆菌弱毒株ATCC25177和/或CMCC93020为菌种，经扩增、灭活、盐析沉降、除菌过滤、检验、稀释及分装，得到结核菌素纯蛋白衍生物成品。解决现有技术中菌种对操作人员、环境危害大，对生产条件要求高等缺陷（P3生产车间），最终得到一种可用于结核病的临床诊断、卡介苗接种对象的筛选、卡介苗接种后机体免疫反应的监测及流行病学监测使用的蛋白。

技术领域

本发明涉及一种结核菌素纯蛋白衍生物的生产方法，尤其涉及一种以结核分枝杆菌弱毒株H37Ra中结核分枝杆菌弱毒株ATCC25177或/和CMCC93020生产结核菌素纯蛋白衍生物的方法，属于生物蛋白制备技术领域。

背景技术

结核病是一种严重危害人类和动物健康的慢性传染病，其中，结核分枝杆菌是结核病的致病菌。2019年全球结核病死亡人数140万，结核病依然是全球头号传染病杀手。据WTO发布的2020全球结核病年度报告：2019年全球结核病发病人数估计1000万左右(890-1100万)；其中，印度264万，占26％；印尼84.6万，占8.5％；中国83.3万，占8.4％。中国结核病人数世界排名第三，还是结核病高负担国家。

我国肺结核患病人数多，据2010年全国第五次结核病流行病学抽样调查结果显示：全国15岁以上人口活动性肺结核患病率为459/10万，涂阳肺结核患病率为66/10万，菌阳肺结核患病率为119/10万。据此，估算全国15岁以上人口现患的活动性肺结核、涂阳和菌阳患者数分别为499万、72万和129万；乡村肺结核患病率均明显高于城镇，西部地区活动性、涂阳和菌阳肺结核患病率均明显高于中部和东部地区。据官方统计，我国结核菌携带者约5.5亿，活动性非结核患者约500万。

因此，结核病的前期筛查和诊断成为结核病预防中最重要的一环。目前，市售的结核病诊断试剂主要为北京祥瑞生物制品有限公司生产的结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)，以及，该公司于2019年01月11日公开了一种公开号为CN109182167A，名称为“一种高效价结核菌素皮试诊断试剂(PPD)生产工艺”的专利文献，其中，具体公开：包括菌培、灭活和沉降；菌培具体工艺为：工作种子菌种首先培养发育为干皱成团呈浅黄色的菌苔，菌苔镜检状态为短粗杆菌，微弯曲两端圆；然后再进行2代培养至多皱、微黄色的菌膜，待菌膜铺满培养基表面、培养液澄清透明时传代进行3代培养，3代培养至形成多皱微黄的菌膜后进行4代培养8-10周。该发明提供的一种富集ESAT-6和CFP10两种抗原的高效价PPD的生产工艺，通过该发明所述工艺制备的PPD效价高，且其中ESAT-6和CFP10含量高。但是，该产品菌种为结核分枝杆菌强毒株CMCC93009(H37Rv)，为二类病原微生物，对生产操作人员身体健康威胁很大，安全防护等级高，对环境潜在威胁大，如出现安全事故，将会是一场局部生态灾难。

随着科学技术的发展，安全要求的提高，此菌种前期申报的生产条件已经不能满足GMP的生产要求。而安全要求低、对生产操作人员威胁小、对环境影响小，用于制造结核菌素纯蛋白衍生物的菌种选择是本行业的发展趋势。

发明内容

本发明旨在解决现有技术中结核菌素纯蛋白衍生物生产工艺的不足(主要是原料菌种缺陷)，而将结核分枝杆菌弱毒株(H37Ra)应用于制备结核菌素纯蛋白衍生物的方法中，以及，根据该菌种提出了相匹配的制备方法，以解决现有技术中菌种对操作人员、环境危害大，对生产条件要求高等缺陷(P3生产车间)，最终得到一种可用于结核病的临床诊断、卡介苗接种对象的筛选、卡介苗接种后机体免疫反应的监测及流行病学监测使用的蛋白。

为了实现上述技术目的，提出如下的技术方案：

一种结核菌素纯蛋白衍生物的生产方法，包括：

以结核分枝杆菌弱毒株ATCC25177(H37Ra)或/和结核分枝杆菌弱毒株CMCC93020(H37Ra)为菌种，经扩增、灭活后，得到含代谢蛋白的菌液；