[发明专利]一种结核菌素纯蛋白衍生物的生产方法

权利要求书

1.一种结核菌素纯蛋白衍生物的生产方法，其特征在于，包括：以结核分枝杆菌弱毒株H37Ra为菌种，经扩增、灭活后，得到含代谢蛋白的菌液；将菌液盐析沉降、酸变性沉降、脱盐超滤及除菌过滤，得到蛋白原液；将蛋白原液检验、稀释及分装，得到结核菌素纯蛋白衍生物成品；

其中，以结核分枝杆菌弱毒株H37Ra中的结核分枝杆菌弱毒株ATCC25177或/和结核分枝杆菌弱毒株CMCC93020为菌种；

在所述扩增中，先在全植物源固体培养基中进行扩增，再在半固体培养基中进行扩增；所述全植物源固体培养基为苏通土豆汤固体培养基，以1000mL计，包括：谷氨酸钠8.0g、磷酸氢二钾0.5g、柠檬酸2.0g、硫酸镁0.5g、柠檬酸铁铵0.05g、甘油60mL、土豆汤940mL及琼脂粉20g；

所述半固体培养基为土豆苏通半固体培养基，以1000mL计，包括：谷氨酸钠8.0g、磷酸氢二钾0.5g、柠檬酸2.0g、硫酸镁0.5g、柠檬酸铁铵0.05g、甘油60mL及注射用水940mL；分装500mL三角瓶，180mL瓶，每瓶放土豆块；

在所述沉降中，灭活后的菌液先采用硫酸铵盐析沉降，再进行三氯乙酸酸变性沉降；其中，硫酸铵盐析沉降1-3次，硫酸铵盐析沉降终饱和度为40-80%，硫酸铵盐析沉降2-24h；三氯乙酸酸变性沉降3-5次，三氯乙酸酸变性沉降浓度为2-4%，三氯乙酸酸变性沉降1-4 h。

2.根据权利要求1所述的结核菌素纯蛋白衍生物的生产方法，其特征在于，在所述三氯乙酸酸变性沉降中，采用三氯乙酸湿法洗菌液中杂质多糖。

3.根据权利要求1所述的结核菌素纯蛋白衍生物的生产方法，其特征在于，在所述脱盐超滤中，采用截留分子量为3-50KD的超滤设备。

4.根据权利要求1所述的结核菌素纯蛋白衍生物的生产方法，其特征在于，在所述除菌过滤中，采用孔径为0.2μm的除菌过滤设备。

5.根据权利要求1所述的结核菌素纯蛋白衍生物的生产方法，其特征在于，在所述稀释中，采用pH7.2-7.4、0.01mol/L 的PBS溶液，PBS溶液包括0.0005%的聚山梨酯-80。