[发明专利]一种从黑水虻幼虫肠道中分离纯化乳酸菌及制备菌剂的工艺方法

说明书

本发明公开了一种从黑水虻幼虫肠道中分离纯化乳酸菌及制备菌剂的工艺方法，所述制备工艺流程为黑水虻预处理、肠道微生物原液制备、肠道乳酸菌悬液制备、扩大培养制备液态菌剂、固态菌剂制备5个关键步骤，从高峰期黑水虻幼虫肠道中分离纯化出高效乳酸菌制备出高浓度菌剂。本发明不仅首次提出自黑水虻幼虫肠道中成功分离高效乳酸菌并制备菌剂的方法，而且显著克服了目前常规方法中乳酸菌分离效果不稳定、菌剂制备难度大、菌剂浓度低等缺陷。利用该黑水虻肠道乳酸菌固态和液态菌剂可大大提高黑水虻生物转化餐厨垃圾过程的转化效率和生物安全性。

技术领域

本发明属于菌剂制备技术领域，特别涉及从黑水虻幼虫肠道中分离纯化乳酸菌及制备菌剂的工艺方法。

背景技术

昆虫肠道系统中寄居的微生物与昆虫的营养生理活动有着密切的关系，并影响昆虫的生命活动，如含有种类繁多的酶系统能参与寄主能力、物质及遗传信息转运等生理活动。昆虫肠道微生物的研究不但有利于昆虫资源的开发利用,而且有利于从昆虫肠道这一特殊环境中获得特殊功能的细菌资源,目前对昆虫肠道微生物的研究零星见于几种重要经济昆虫如家蚕﹑白蚁、蜜蜂等。

黑水虻作为近年来一种新型重要的资源昆虫，其拥有丰富蛋白质和适当的脂肪和微量元素，是联合国粮农组织推荐的饲用昆虫，被认为是优良的人畜蛋白来源。同时，作为腐生性昆虫，黑水虻被大量用于有机废弃物的处理，近年来利用黑水虻对餐厨垃圾进行高效转化资源的报道也越来越多。但是从黑水虻幼虫肠道微生物中分离纯化有益微生物的研究还较少，对于从黑水虻幼虫肠道中分离纯化乳酸菌并制备菌剂的报道还未见。

发明内容

本发明正是针对现有技术中存在的问题，提供一种从黑水虻幼虫肠道中分离纯化乳酸菌并制备菌剂的工艺方法，该技术方案中乳酸菌分离效果稳定、菌剂制备简单，菌剂可大大提高黑水虻生物转化餐厨垃圾过程的转化效率和生物安全性，具有良好的应用前景。本发明是通过以下技术方案实现的：

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下，一种从黑水虻幼虫肠道中分离纯化乳酸菌及制备菌剂的工艺方法，具体步骤如下：

步骤(1)黑水虻预处理：取高峰期黑水虻幼虫预先饥饿处理8-12小时，用自来水和无菌水依次分别冲洗2-3次，然后无菌条件下用75％的乙醇浸泡幼虫1-2min，用0.1％的高锰酸钾溶液浸泡幼虫1-2min，再次用无菌水清洗幼虫2-3次，无菌条件下风干。对黑水虻虫体表面进行灭菌操作，保证虫体表面为无菌状态。

步骤(2)肠道微生物原液制备：无菌条件下对经过预处理的黑水虻幼虫进行解剖。取出虫体肠道后加入1-2mL无菌水研磨，所得肠道研磨液进行涡旋振荡5-10min，而后静置30-60min，取上清液进行10^-1-10^-5梯度稀释获得肠道微生物原液。该步骤为菌原液的获取，目的是解剖黑水虻得到肠道，然后从肠道中提取乳酸菌，为提取菌的必须步骤。

步骤(3)肠道乳酸菌悬液制备：将不同梯度的肠道微生物原液涂布于MRS培养基平板，37℃下培养20-30h，挑出形态特征及长势较好的乳酸菌经过3-5次划线分离后得到纯化的黑水虻幼虫肠道乳酸菌，最后对纯化菌落用1-2mL无菌磷酸盐缓冲液进行重悬得到肠道乳酸菌悬液，在4℃下保存,该步骤的目的是从黑水虻肠道中获得乳酸菌。

步骤(4)扩大培养制备液态菌剂：将肠道乳酸菌悬液依次接种至15mL、100mL、1L、10LMRS液体培养基于37℃条件下进行扩大培养，获得最终液态菌剂，每轮扩大培养时间均为30-40h,该步骤能够在保证浓度的同时获的大量的乳酸菌菌液。

步骤(5)固态菌剂制备：将液态菌剂按照比例接种至无菌固态培养基中，混匀后用双层医用纱布密封，经30-37℃无菌条件下进行发酵培养24-48h，再置于35℃条件下恒温干燥72h得到黑水虻幼虫肠道乳酸菌高密度固态菌剂,该步骤为固态菌剂的制备步骤，优点是能够方便简单的获得高密度固态菌剂。

进一步地，所述高峰期黑水虻幼虫为4龄幼虫或5龄幼虫前期。