[发明专利]一种从黑水虻幼虫肠道中分离纯化乳酸菌及制备菌剂的工艺方法

权利要求书

1.一种从黑水虻幼虫肠道中分离纯化乳酸菌及制备菌剂的工艺方法，具体步骤如下：

1)黑水虻预处理：取高峰期黑水虻幼虫预先饥饿处理8-12小时，用自来水和无菌水依次分别冲洗2-3次，然后在无菌条件下用75％的乙醇浸泡幼虫1-2min，用0.1％的高锰酸钾溶液浸泡幼虫1-2min，再次用无菌水清洗幼虫2-3次，无菌条件下风干；

2)肠道微生物原液制备：无菌条件下对经过预处理的黑水虻幼虫进行解剖，取出虫体肠道后加入1-2mL无菌水研磨，所得肠道研磨液进行涡旋振荡5-10min，而后静置30-60min，取上清液进行10^-1-10^-5梯度稀释获得肠道微生物原液；

3)肠道乳酸菌悬液制备：将不同梯度的肠道微生物原液均匀涂布于MRS培养基平板，37℃下培养30-40h，挑出形态特征及长势较好的乳酸菌经过3-5次划线分离后得到纯化的黑水虻幼虫肠道乳酸菌，对纯化菌落用1-2mL无菌磷酸盐缓冲液进行重悬得到肠道乳酸菌悬液，在4℃下保存；

4)扩大培养制备液态菌剂：将肠道乳酸菌悬液依次接种至15mL、100mL、1L、10LMRS液体培养基于37℃条件下进行扩大培养，获得最终液态菌剂，每轮扩大培养时间均为30-40h；

5)固态菌剂制备：将液态菌剂按照比例接种至无菌固态培养基中，混匀后用双层医用纱布密封，经30-37℃无菌条件下进行发酵培养24-48h，再置于35℃条件下恒温干燥72h得到黑水虻幼虫肠道乳酸菌高密度固态菌剂。

2.根据权利要求1所述的一种从黑水虻幼虫肠道中分离纯化乳酸菌及制备菌剂的工艺方法，其特征在于，高峰期黑水虻幼虫为4龄幼虫或5龄幼虫前期。

3.根据权利要求1所述的一种从黑水虻幼虫肠道中分离纯化乳酸菌及制备菌剂的工艺方法，其特征在于，将MRS液态培养基与无菌椰渣按质量比3-5：5的比例充分混合后，高压灭菌后得到无菌固态培养基，无菌固态培养基pH值为5.5-6，粒径为5mm以下。

4.根据权利要求1所述的一种从黑水虻幼虫肠道中分离纯化乳酸菌及制备菌剂的工艺方法，其特征在于，乳酸菌发酵液即扩大培养的黑水虻肠道乳酸菌液态菌剂与无菌固态培养基的接种质量比为1-2：1。

5.根据权利要求1所述的一种从黑水虻幼虫肠道中分离纯化乳酸菌及制备菌剂的工艺方法，其特征在于，乳酸菌液态菌剂的活菌含量达到1×10¹²cfu/mL以上，乳酸菌固态菌剂的活菌含量达到1×10¹⁰cfu/g以上。

6.根据权利要求5所述的从黑水虻幼虫肠道中分离纯化的乳酸菌固态菌剂和乳酸菌液态菌剂，其特征在于，以0.05％-1％的比例接种应用于黑水虻生物转化餐厨垃圾过程中可将转化效率提高20％以上。