[发明专利]一种检测柞蚕肠球菌的巢式PCR引物、试剂盒及检测方法

说明书

本发明公开了一种检测柞蚕肠球菌的巢式PCR引物、试剂盒及检测方法。本发明根据生物信息学分析找到的肠球菌属保守的单拷贝基因DNA依赖的RNA聚合酶β亚基，设计引物对待测样品进行巢式PCR。此方法避免了因为柞蚕肠球菌菌株变异影响PCR检出率，且因为巢式PCR的高度灵敏与特异性，可以快速的监测蚕病并进行早期预防性治疗，甚至可通过试子检测卵面、蚕具、蚕室，对外来蚕卵进行监测，检验蚕具和蚕室的消毒效果，为避免柞蚕链球菌外部来源的传染或内部来源的交叉感染提供有效的防控手段，甚至可成为蚕业标准化饲养流程的重要组成部分。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测柞蚕肠球菌的巢式PCR引物、试剂盒及检测方法。

背景技术

柞蚕肠球菌（Enterococcus pernyi）是引起柞蚕空胴病与蓖麻蚕软腐病的病原，其通过污染的卵、污染的蚕具、野外带菌的蚕蛾、蚕沙等排泄物传播。初孵化的蚁蚕通过噬食或接触带菌卵壳，便把柞蚕肠球菌食下而感染，或者健康的蚕接触了带菌的蚕沙、稀粪、呕吐液均含有大量的柞蚕肠球菌，污染饲料、蚕具、蚕室而交叉传染。此外，柞蚕肠球菌还可能通过蝇类传播，并且研究表明柞蚕肠球菌对紫外线的抗性较强，使得防控其传染变得非常棘手。

柞蚕在整个生长发育过程中，从1龄到5龄都能受到柞蚕肠球菌的危害，均有症状表现，特别是1、2、3眠和老眠起发病较多。柞蚕蚕眠起后，照常吃叶，2~3天后开始发病，主要表现行动迟缓，多呆在柞枝上，不爱吃叶，发育慢，蚕体瘦弱略收缩，消食管中空虚无硬粪粒。常排泄黑褐色稀粪，肛门处被稀粪污染。病势再发展，蚕体越加显得头大尾小，刚毛长，最后病蚕用尾足或用尾足与腹足抱住柞枝，头胸部下垂而死。死后尸体不溃烂，无腥臭恶味。

蓖麻蚕全龄期可感染柞蚕肠球菌，不同龄期幼虫感染症状不同。蚕具或卵面污染即可让柞蚕肠球菌感染整批蓖麻蚕，1龄期不发病，蜕皮后在2龄集体发病，不爱食叶，蚕体瘦弱，排稀粪，呕吐，最后蚕体坍缩而死，死后蚕体发黑。高龄蚕感染症状可不致死，蚕体排稀便伴有臭味，可化蛹但蛹普遍畸形，蛹可不吐丝直接化蛹，畸形蛹羽化率降低并且常伴羽化失败现象，对生产有毁灭性打击。

柞蚕肠球菌的感染以预防为主，治疗为辅，蚕一旦发病很难治愈并且影响下一代的生产并可能造成下一代的交叉污染。然而，目前还未报道有效的柞蚕肠球菌的监测方法。

发明内容

为了克服上述现有技术中的不足，本发明提供一种检测柞蚕肠球菌的巢式PCR引物、试剂盒及检测方法。

本发明的第一个目的是提供一种检测柞蚕肠球菌的巢式PCR引物，包括以下引物：

外侧引物：

EperDDRPβF：5’-CTCAAGGTCTTCCTCGTGTCCA-3’（如SEQ ID NO.2所示），EperDDRPβR：5’-ACTTTACGAAGCATTTGGCGAAC-3’（如SEQ ID NO.3所示）；

内侧引物：

EperDDRPβU：5’-ATCTTTGAAGCACGTAATCCGAA-3’（如SEQ ID NO.4所示），EperDDRPβL：5’-GCCGATTTCTACCCCTTGCAT-3’（如SEQ ID NO.5所示）。

本发明的第二个目的是提供一种检测柞蚕肠球菌的试剂盒，包括上述的巢式PCR引物。

本发明的第三个目的是提供一种柞蚕肠球菌的检测方法，包括以下步骤：提取待测样品的DNA作为模板，使用上述的外侧引物EperDDRPβF和EperDDRPβR进行第一轮PCR扩增，以第一轮PCR扩增产物作为模板，使用上述的内侧引物EperDDRPβU和EperDDRPβL进行第二轮PCR扩增，利用琼脂糖凝胶电泳检测第一轮PCR扩增产物和第二轮PCR扩增产物，若只有第二轮PCR扩增产物有1条电泳条带，或者第一轮PCR扩增产物和第二轮PCR扩增产物均有1条电泳条带，说明待测样品中含有柞蚕肠球菌。