[发明专利]一种猪流行性腹泻病毒M基因的荧光探针引物组合、试剂盒及应用

说明书

本发明涉及一种猪流行性腹泻病毒M基因的荧光探针引物组合、试剂盒及应用，荧光探针引物组合包括上游引物PEDV‑MF、下游引物PEDV‑MR和荧光探针PEDV‑P，并公开了其碱基序列。与现有技术相比，本发明通过PEDV不同毒株M基因的序列比对，选取M基因的中段保守序列设计引物及探针，目的片段约为189bp，能够最大限度识别PEDV的所有毒株，而且引物灵敏度较高，特异性较强，稳定性较好。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及流行性腹泻病毒M基因检测，尤其是涉及一种猪流行性腹泻病毒M基因的荧光探针引物组合、试剂盒及应用。

背景技术

PEDV属冠状病毒属，呈现多形性，大小95-190nm(包括纤突)。核酸为线性单股正链RNA，外包衣壳。有囊膜，囊膜上有放射状纤突。PEDV有纤突蛋白(S)、小膜蛋白(sM)、膜蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)4种结构蛋白，以及POL(polymerase)基因编码的复制酶1a、1b蛋白和ORF3基因编码ORF3蛋白。

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一种以仔猪水样腹泻、呕吐和脱水为主要临床特征的急性、高度接触性传染病。由于该病对新生仔猪的感染率和致死率均很高，给养猪业造成了巨大的经济损失。特别是在冬季，流行性腹泻病毒更容易爆发，表现为发病率和致死率高、流行广、损失大的特征。因此早发现早控制，能够有效的减少损失，这就需要建立一种快速、灵敏度高、特异性强的检测方法，对PEDV进行确诊和监测。

发明内容

本发明的目的就是为了提供一种猪流行性腹泻病毒M基因的荧光探针引物组合、试剂盒及应用。

PEDV的M蛋白作为一个膜糖蛋白，在PED病毒的遗传进化过程中很少发生突变，从而保证宿主识别的一致性。因此M基因具有高度的保守性。本发明通过PEDV不同毒株M基因的序列比对，选取M基因的中段保守序列设计引物及探针，目的片段约为189bp，能够最大限度识别PEDV的所有毒株，并研制方便诊断的试剂盒，建立相应的检测方法。

本发明通过分析PEDV的遗传进化树，将不同分支的26个典型的PEDV毒株进行M蛋白氨基酸序列的比对，发现M蛋白的第68-132个氨基酸最保守，同源性为100％，因此选取此段基因序列设计引物，参见图5和图6。最终PCR产物序列为M基因的第265-453BP：

CCAACTGGTGTAACGCTAACACTCCTTAGTGGTACATTGCTTGTAGAGGGCTATAAGGTTGCTACTGGCGTACAGGTAAGTCAATTACCTAATTTCGTCACAGTCGCCAAGGCCACTACAACAATTGTCTACGGACGTGTTGGTCGTTCAGTCAATGCTTCATCTGGCACTGGTTGGGCTTTCTATGTC。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明第一方面提供一种猪流行性腹泻病毒M基因的荧光探针引物组合，包括上游引物PEDV-MF(SEQ ID NO:1)、下游引物PEDV-MR(SEQ ID NO:2)和荧光探针PEDV-P(SEQID NO:3)，分别具有以下碱基序列：

上游引物PEDV-MF：5’-CCAACTGGTGTAACGCTAAC-3’，

下游引物PEDV-MR：5’-GACATAGAAAGCCCAACCAG-3’，

荧光探针PEDV-P：FAX-AGGGCTATAAGGTTGCTACTGGCGT-TAMRA。

本发明第二方面提供一种猪流行性腹泻病毒M基因的试剂盒，含有所述的荧光探针引物组合，并记为PCR Mix。

优选地，该试剂盒还包括阳性对照、阴性对照、反转录试剂和PCR扩增液。