[发明专利]一种猪流行性腹泻病毒M基因的荧光探针引物组合、试剂盒及应用

权利要求书

1.一种猪流行性腹泻病毒M基因的荧光探针引物组合，其特征在于，包括上游引物PEDV-MF、下游引物PEDV-MR和荧光探针PEDV-P，分别具有以下碱基序列：

上游引物PEDV-MF：5’-CCAACTGGTGTAACGCTAAC-3’，

下游引物PEDV-MR：5’-GACATAGAAAGCCCAACCAG-3’，

荧光探针PEDV-P：FAX-AGGGCTATAAGGTTGCTACTGGCGT-TAMRA。

2.一种猪流行性腹泻病毒M基因的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的荧光探针引物组合，并记为PCR Mix。

3.根据权利要求2所述的一种猪流行性腹泻病毒M基因的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括阳性对照、阴性对照、反转录试剂和PCR扩增液。

4.根据权利要求2或3所述的一种猪流行性腹泻病毒M基因的试剂盒，其特征在于，PCRMix中，上游引物PEDV-MF、下游引物PEDV-MR和荧光探针PEDV-P的摩尔比为1:1:1。

5.根据权利要求3所述的一种猪流行性腹泻病毒M基因的试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照为含有669bp的PEDV基因序列的重组质粒，目的片段位于该序列中心区域。

6.根据权利要求3所述的一种猪流行性腹泻病毒M基因的试剂盒，其特征在于，所述的阴性对照为双蒸水。

7.根据权利要求3所述的一种猪流行性腹泻病毒M基因的试剂盒，其特征在于，所述的PCR扩增液包括荧光定量qPCR Mix(2×)。

8.如权利要求2～7任一所述的猪流行性腹泻病毒M基因的试剂盒的应用，其特征在于，将其应用于检测猪流行性腹泻病毒，包括以下方法：

1)提取待测样品的RNA，利用反转录试剂反转录得到样品cDNA；

2)配制反应体系：取样品cDNA、PCR Mix、PCR扩增液，并用双蒸水定量至一定体积，配制反应体系；

3)荧光定量PCR扩增；

4)参照待测样品对阳性对照和阴性对照进行处理；

5)结果判定。

9.根据权利要求8所述的猪流行性腹泻病毒M基因的试剂盒的应用，其特征在于，步骤(4)中的结果判定方法为：

阳性对照Ct值＜30并出现特异的S型扩增曲线，阴性对照无Ct值且无特异的扩增曲线，实验结果成立；

待测样品Ct值＜35并出现特异的S型扩增曲线，判为猪流行性腹泻病毒核酸阳性；无Ct值且无特异的扩增曲线，判为猪流行性腹泻病毒核酸阴性；35＜CT值≤40并出现特异的扩增曲线，判为猪流行性腹泻病毒核酸可疑，可疑样品需重新取样提取RNA，进行复检，Ct值＜40判为阳性，否则判为阴性；

对于未呈现S型扩增曲线的待测样品，判为阴性。

10.根据权利要求8所述的猪流行性腹泻病毒M基因的试剂盒的应用，其特征在于，包括以下条件中的任一项或多项：

(i)步骤(1)中，取待测样品的RNA，反转录的条件为42℃下进行45min；

(ii)步骤(2)的反应体系中，样品cDNA 2μL，PCR Mix 3μL，PCR扩增液10μL，并加入双蒸水10.5μL定量至25μL；

(iii)步骤(3)中，扩增程序为：95℃1min，循环为95℃5s，60℃35s(采集荧光信号)，共计40个循环，报告基团“FAM”，淬灭基团“TAMRA”。