[发明专利]一种基于脱氧核酶的细胞外ATP快速传感方法及应用试剂盒

说明书

本发明公开了一种基于脱氧核酶的细胞外ATP快速传感方法及应用试剂盒，属于分析检测领域。一种脱氧核酶，所述脱氧核酶包括核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的脱氧核苷酸链，在SEQ ID NO.2所示的脱氧核苷酸链的5'端连有羟基，3'端连有胆固醇分子。一种基于脱氧核酶的细胞外ATP快速传感方法的步骤简单、响应快速，可实现对细胞外分泌ATP分子的快速传感与测定，可有效区分其他细胞外核苷酸包括ADP、AMP和腺苷等物质，实现准确测定，可广泛应用于细胞生长、组织损伤、炎症和移植免疫等各种生理和病理研究过程中，可更好地理解ATP的信号机制以及其在基本病理、生理过程中的功能。

技术领域

本发明属于分析检测领域，具体涉及一种基于脱氧核酶的细胞外ATP快速传感方法及应用试剂盒。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

自1994年首次通过体外筛选技术获得具有催化活性的DNA(又称脱氧核酶或DNAzyme)以来，到目前为止，已经发现了许多可催化裂解RNA的DNAzymes(简称RCDz)。这些RCDz广泛应用于临床诊断、药物研发、环境监测和生物传感等领域。例如，RCDz可作为传感器和显像剂用于细胞内金属离子以及其他目标分子成像。但时间分辨率较低，这些RCDz传感器通常需要数分钟甚至数小时才能读出信号，这极大的限制了其传感性能。因此，亟需开发具有高时间分辨率或快速响应的DNAzyme传感器。

三磷酸腺苷(ATP)是一种重要的细胞外信号指示剂，在细胞生长、组织损伤、炎症和移植免疫等各种生理和病理过程中，细胞都会向外释放ATP。因此，监控ATP的释放过程，可以更好地理解其信号机制以及研究相关的病理、生理过程。尽管已经研发出基于核酸适配体的传感器，用于分析细胞内ATP，但是针对细胞间复杂的信号传递的情况下，该方法无法保证对ATP的检测特异性，甚至无法区分细胞外的ADP和AMP，因此，对细胞外ATP的监测仍然是一个重大挑战和技术难点。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种基于脱氧核酶的细胞外ATP快速传感方法。利用具有自磷酸化催化功能的特定结构的脱氧核苷酸链为传感分子(已修饰荧光基团，简称^FDK1)，并将其固定至细胞膜表面，当细胞释放ATP分子时，^FDK1可催化底物ATP分子的γ-磷酸基团移到其自身序列的5'-羟基端，实现磷酸化，再与具有荧光猝灭基团(^QDO)的DNA链进行碱基互补配对，完成荧光猝灭，形成较低的荧光检测背景，利用λ噬菌体核酸外切酶(λ-exo)将5'-磷酸化的脱氧核苷酸链分子切割至短链，进而产生强烈的荧光信号，可在数秒内完成细胞外ATP分子的快速传感。

本发明的技术方案为：

一种脱氧核酶，所述脱氧核酶包括如SEQ ID NO.2所示的脱氧核苷酸链，在SEQ IDNO.2所示的脱氧核苷酸链的5'端连有羟基，3'端连有胆固醇分子。

进一步地，上述技术方案中，所述脱氧核酶具有自磷酸化催化功能，可以固定在细胞膜表面。

一种基于脱氧核酶的细胞外ATP快速传感方法，脱氧核酶催化底物ATP分子的γ-磷酸基团移到脱氧核酶自身序列的5'-羟基端，磷酸化的脱氧核酶再与SEQ ID NO.3所示的具有荧光猝灭基团(^QDO)的DNA链进行碱基互补配对，利用λ噬菌体核酸外切酶(λ-exo)将5'-磷酸化的脱氧核苷酸核酶切割至短链，产生荧光信号，完成细胞外ATP分子传感。

进一步地，上述技术方案中，一种基于脱氧核酶的细胞外ATP快速传感方法，包括以下步骤：

a)对SEQ ID NO.1所示的ATP识别分子进行荧光标记，形成SEQ ID NO.2所示的所示的脱氧核酶；