[发明专利]一种基于脱氧核酶的细胞外ATP快速传感方法及应用试剂盒

权利要求书

1.一种脱氧核酶，其特征在于：所述脱氧核酶为GGAAGAGTGGTGACGTTGGTGATAAAGACCGCGCT-FAM-AGGGTCTGCAAGGGAGGAGTTTTTTTTTT-cholesterol，所述脱氧核酶的5'端含有羟基。

2.一种基于脱氧核酶的细胞外ATP快速传感方法，其特征在于：权利要求1所述的脱氧核酶催化底物ATP分子的γ-磷酸基团移到脱氧核酶自身序列的5'-羟基端，磷酸化的脱氧核酶再与具有荧光淬灭基团的DNA链进行碱基互补配对，利用λ噬菌体核酸外切酶将5'-磷酸化的脱氧核酶切割至短链，产生荧光信号，完成细胞外ATP分子传感；所述具有荧光淬灭基团的DNA链为Dabcyl-CGCGGTCTTTATCACCAACGTCACCACTCTTCC。

3.根据权利要求2所述的一种基于脱氧核酶的细胞外ATP快速传感方法，其特征在于：包括以下步骤：

a）对SEQ ID NO.1所示的ATP识别分子进行荧光标记；

b）在脱氧核酶的3'端修饰胆固醇分子，形成权利要求1所述的脱氧核酶，使脱氧核酶可与细胞膜反应，将脱氧核酶固定在细胞膜表面；

c）将细胞在玻璃基培养皿中孵育；

d）向细胞玻璃基培养皿中加入脱氧核酶，进行孵育，使脱氧核酶被固定在细胞膜表面，固定后采用洗涤液洗涤细胞；

e）向步骤d）中的细胞加入带有金属离子辅助因子的缓冲溶液，用于辅助脱氧核酶自磷酸化催化过程；

f）对步骤e）中的细胞进行刺激，使细胞释放出ATP分子；

g）向步骤f）中的细胞中加入荧光淬灭试剂和λ噬菌体核酸外切酶，孵育；所述荧光淬灭试剂为Dabcyl-CGCGGTCTTTATCACCAACGTCACCACTCTTCC；

h）采用激光扫描共焦显微镜对细胞进行成像，激发和发射波长与所用荧光标记的分子的激发和发射波长相匹配，使用Image J软件计算荧光定量数据。

4.根据权利要求3所述的一种基于脱氧核酶的细胞外ATP快速传感方法，其特征在于：所述步骤d）中向细胞玻璃基培养皿中加入脱氧核酶的浓度为100~300 nmol/L，洗涤液为20~30 mmol/L HEPES，120~140 mmol/L NaCl，5~10 mmol/L KCl，1~3 mmol/L CaCl₂，2~4mmol/L MgCl₂，3~6 mmol/L葡萄糖。

5.根据权利要求3所述的一种基于脱氧核酶的细胞外ATP快速传感方法，其特征在于：所述步骤e）中带有金属离子辅助因子的缓冲溶液中的金属离子包括Mn²⁺、Cd²⁺或Zn²⁺；所述带有金属离子辅助因子的缓冲溶液还包括100~120 mmol/L HEPES，600~900 mmol/L NaCl，100~300 mmol/L KCl。

6.根据权利要求3所述的一种基于脱氧核酶的细胞外ATP快速传感方法，其特征在于：所述步骤f）中的刺激包括化学刺激或者物理刺激；所述化学刺激包括谷氨酸刺激、凝血酶刺激或钙离子刺激，所述物理刺激包括采用微电极进行电刺激、机械刺激或流体剪切应力刺激。

7.根据权利要求3所述的一种基于脱氧核酶的细胞外ATP快速传感方法，其特征在于：所述步骤g）中的λ噬菌体核酸外切酶的最终浓度为20~30 μmol/L，荧光淬灭试剂的最终浓度为1~3 μmol/L。

8.一种基于脱氧核酶的细胞外ATP快速检测试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的脱氧核酶、带有Mn²⁺、Cd²⁺或Zn²⁺辅助因子的缓冲溶液、荧光淬灭试剂和λ噬菌体核酸外切酶；所述荧光淬灭试剂为Dabcyl-CGCGGTCTTTATCACCAACGTCACCACTCTTCC。