[发明专利]一种DNA克隆方法

说明书

本发明公开了一种DNA克隆方法，通过设计一对引物，引物的一端与载体配对，另一端与目的基因片段配对；当把目的基因片段、线性化的载体及引物混合后，在外切核酸酶的作用下，载体片段和目的基因片段5’端的碱基被逐渐切掉，露出3’突出的单链区，此时，引物能与单链区互补配对，并互为引物和模板，在DNA聚合酶的作用下延伸，使载体和目的基因片段具有重叠区，延伸产物又在外切核酸酶作用下，使重叠区被切成单链，这时目的基因片段和载体片段的单链区能够通过互补配对退火，在DNA聚合酶作用下延伸，最后在连接酶作用下连接成环状DNA。不必依赖PCR扩增目的基因，减少了PCR引起的突变；可以从DNA混合物中特异性地克隆目的片段；不留酶切位点的痕迹。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种DNA克隆方法。

背景技术

经典的分子克隆方法依赖限制性内切酶酶切连接的方法克隆基因片段，克隆所得片段往往含多余的酶切位点附近的序列，另外存在基因片段越大，酶切位点可选择性越小的问题。聚合酶链式反应(PCR)发明之后，因其能高效扩增目的基因片段，而广泛应用于分子克隆。PCR既可以利用引物5’末端加酶切位点及其保护碱基，扩增目的基因片段，酶切后再连接入特定载体中；也可以利用引物5’末端加与载体匹配的序列，扩增目的基因片段，通过体外重组或体内重组的方式克隆目的基因片段。

尽管科学家们经过不懈努力获得了很多功能改善的DNA聚合酶，PCR扩增仍然存在一些问题：比如长片段PCR突变率高、扩增效率低等。所以我们需要一些PCR依赖性小的分子克隆方法作为补充。

公开号为CN102604982A的发明申请公开了一种利用外切核酸酶活性的无痕克隆及重组方法，所述方法是在目的基因两端分别加上与克隆载体插入位点两端序列相同的长度为10～30bp的DNA片段后与载体DNA在外切核酸酶作用下进行重组，即在制备目的基因片段时，在扩增引物的5’端分别加上与克隆载体插入位点两端序列相同的长度为10～30bp的DNA片段。然而，该技术方案中准备载体DNA和目的基因时均需要使用PCR扩增，用PCR扩增的方法在目的基因两端分别加上与克隆载体插入位点两端序列相同的重组片段。

公开号为CN103074358A的发明申请公开了一种模拟重组无痕克隆方法，所述方法包括：(1)载体DNA制备：以克隆载体质粒为模板，以目的基因插入位点两端的序列为结合位点设计引物，并在引物5’端分别加上与目的基因匹配的长度为20～30bp的序列，所得上游引物记为primer1，下游引物记为primer2，以primer1和primer2为引物进行PCR扩增获得载体DNA；(2)目的基因制备：经酶切或扩增获得包含目的基因的片段；(3)基因重组：将步骤(1)载体DNA和步骤(2)所得片段混合，先加入λExonuclease，37℃反应30min，72℃温浴5min，50℃温浴30min，然后温度降至37℃，加入T4 DNA聚合酶和dNTPs，37℃反应15min，获得重组DNA。同样的，该技术方案中也需要使用PCR扩增，即需要以克隆载体质粒为模板，以目的基因插入位点两端的序列为结合位点设计引物，并在引物5’端分别加上与目的基因匹配的长度为20～30bp的序列，所得上游引物记为primer1，下游引物记为primer2，以primer1和primer2为引物进行PCR扩增获得载体DNA。

上述公开号为CN102604982A和CN103074358A的发明申请的方法均需要通过PCR扩增目的基因片段或载体片段。当这些片段存在GC含量特别高或特别低、片段特别长、有重复序列、含有稳定的二级结构等情况时，PCR往往不能有效扩增这些片段，上述方法就不能应用。此外，PCR扩增存在突变率高的问题，片段越长突变率越高，对短片段来说，使用高保真酶扩增，其突变率会变得很低，测序筛选到未突变的片段也比较容易，而对长片段来说即使用高保真的DNA聚合酶，PCR扩增造成的突变率增加的同时，测序筛选正确克隆的难度也成倍增加。本发明不依赖于PCR扩增，能够避免上述方法中存在的问题。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的上述不足，提供了一种不依赖于PCR的DNA克隆方法。