[发明专利]一种DNA克隆方法

权利要求书

1.一种DNA克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提供双链的线性化载体、双链的目的基因片段及一对引物，引物包括上游引物和下游引物，上游引物的两端分别具有与线性化载体及目的基因片段其中一端的3’到5’方向互补的配对区，下游引物的两端分别具有与线性化载体及目的基因片段另一端的3’到5’方向互补的配对区；

(2)线性化载体和目的基因片段在外切核酸酶作用下，双链两端的5’端碱基被顺序切除，露出3’端的单链区用于与引物进行互补配对，互补配对后在DNA聚合酶作用下延伸，使线性化载体和目的基因片段的两端具有配对区；

(3)步骤(2)得到的两端具有配对区的线性化载体和目的基因片段再次在外切核酸酶作用下，双链两端的5’端碱基被顺序切除，露出3’端的单链区用于具有配对区的线性化载体和目的基因片段之间的互补配对，互补配对后在DNA聚合酶作用下延伸，最后在连接酶作用下连接成环状DNA，得到目的基因片段克隆到线性化载体中的克隆产物。

2.根据权利要求1所述的DNA克隆方法，其特征在于，步骤(2)和(3)采用一锅法反应，在反应体系中同时加入步骤(1)中双链的线性化载体、双链的目的基因片段及一对引物，以及外切核酸酶、DNA聚合酶、连接酶和dNTPs。

3.根据权利要求2所述的DNA克隆方法，其特征在于，外切核酸酶为T7外切核酸酶；DNA聚合酶为Taq DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶或KOD DNA聚合酶中的至少一种；连接酶为TaqDNA连接酶。

4.根据权利要求3所述的DNA克隆方法，其特征在于，步骤(2)和(3)采用一锅法反应时，反应体系为：

不足部分用ddH2O补足。

5.根据权利要求3所述的DNA克隆方法，其特征在于，步骤(2)和(3)采用一锅法反应时反应温度为45℃，反应时间为30min。

6.根据权利要求1所述的DNA克隆方法，其特征在于，步骤(1)中双链的线性化载体由环状DNA载体经限制性内切酶酶切获得。

7.根据权利要求1所述的DNA克隆方法，其特征在于，步骤(1)中双链的目的基因片段由克隆有目的基因的环状DNA经限制性内切酶酶切获得。

8.根据权利要求1所述的DNA克隆方法，其特征在于，步骤(1)中上游引物和下游引物两端与线性化载体及目的基因片段之间的配对区序列长度为18bp～30bp。

9.根据权利要求1所述的DNA克隆方法，其特征在于，步骤(3)克隆产物转化大肠杆菌感受态细胞后，筛选获得含有正确克隆产物的重组大肠杆菌。