[发明专利]一种猪盖他病毒NSP1基因的检测试剂盒及其检测方法

说明书

本发明属于生物医学专业领域，具体涉及一种猪盖他病毒NSP1基因的检测试剂盒及其检测方法。该诊断试剂盒包括特异性引物和荧光探针，特异性引物中的上游引物序列为5’‑CCATCCTGGACGTGGGTAGT‑3，下游引物序列为5’‑TTTCGCCAGTTTTCGAGCGT‑3；荧光探针序列为5′‑FAM‑ACCACACCTACCACTGCATCTGCCCCA‑TAMRA‑3′。本试剂盒可对盖他病毒(GETV)进行早期检测，是一种快速、简便、特异、灵敏的检测GETV的方法，具有非常好的应用前景。

技术领域

本发明属于生物医学专业领域，具体涉及一种猪盖他病毒NSP1基因的检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

盖他病毒(GETV)属于一种新发传染病，主要在马和猪之间爆发，可引起初生仔猪出现局部震颤、精神萎靡不振，有较高的死亡率，因而对该病早期快速诊断极为重要。目前尚未有效的手段对盖他病毒(GETV)进行快速、准确的检测，因此针对该病毒研制一种快速检测试剂盒，成为目前亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种针对盖他病毒检测试剂盒及其检测方法。本发明人经前期研究，基于TaqMan小沟结合为基础的探针(TAMRA)设计了一种特异性高、重复性好的荧光探针，可作为一种快速、简便、特异的GETV感染诊断试剂盒。该试剂盒的特异性引物和荧光探针是基于对GenBank中6株GETV基因组序列的NSP1基因的保守区域设计的，具有很好的保守性，从而完成了本发明。

本发明提供采用如下技术方案：

一种猪盖他病毒NSP1基因的检测试剂盒，包括特异性引物和荧光探针，特异性引物中的上游引物序列为5’-CCATCCTGGACGTGGGTAGT-3，下游引物序列为5’-TTTCGCCAGTTTTCGAGCGT-3；荧光探针序列为5′-FAM-ACCACACCTACCACTGCATCTGCCCCA-TAMRA-3′。其中荧光探针标记的FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团。

进一步的，该试剂盒中其他组成，可按本领域常规进行选择，例如还可包括ProbeqPCR MIX，也可使用PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶代替。

上述试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

1)提取样品GETV-NSP1的DNA或反转录得到cDNA，构建样品GETV-NSP1-pBM16克隆质粒作为模板；

2)将模板、Probe qPCR MIX、特异性引物、荧光探针和水配成PCR反应体系，进行PCR扩增反应；

3)以阳性标准品GETV-PBM16A为模板相同条件下进行PCR扩增反应，以标准品溶液拷贝浓度的对数值为横坐标、标准品Ct值为纵坐标绘制标准曲线。

4)当样品Ct值≤28.0且出现典型扩增曲线为检测阳性；

5)根据样品测得的Ct值，对照标准曲线，获得样品的拷贝浓度。

进一步的，所述步骤2)或3)的PCR体系中特异性引物浓度为4umol/L，荧光探针浓度为6umol/L，PCR反应条件如下：95℃变性5分钟，95℃30秒、50℃20秒，进行40个循环扩增。

该方法的最低核酸检出量为8.8369×10¹copies/μL。

本发明中，针对检测GETV-NSP1基因的荧光探针试剂盒，具有特异性高、背景值低的优点。该试剂盒中的特异性引物和荧光探针是基于非结构蛋白基因序列设计的，因为它们在基因组中高度保守，但含有足够的遗传变异以区别于其他α病毒。当阳性对照CT值≤28.0且出现典型扩增曲线，阴性对照无CT值无扩增曲线时，检测结果为阳性。