[发明专利]一种基于酶法合成烟酰胺单核苷酸的方法

说明书

本发明提供了一种基于酶法合成烟酰胺单核苷酸(NMN)的方法，其以D‑核糖、烟酰胺、ATP为底物，在核糖激酶、磷酸核糖变位酶及烟酰胺核糖激酶的偶联催化作用下，一锅法合成得到烟酰胺单核苷酸。本发明制备NMN的方法开辟了一条酶法合成NMN的新途径。本发明中的三种酶可以循环利用、成本低、节能环保，适用于规模化工业生产。

技术领域

本发明属于生物制药和生物催化技术领域，涉及一种基于酶法合成烟酰胺单核苷酸的新方法。

背景技术

烟酰胺单核苷酸(β-Nicotinamide mononucleotide，简称β-NMN或者NMN)是烟酰胺磷酸核糖转移酶反应的产物，是NAD+的关键前体，其在被烟酰胺核苷酸腺苷转移酶腺苷化后变成NAD+。人体细胞外NMN需要去磷酸转化为烟酰胺核糖(NR)才能进入肝细胞内部，随后NR在烟酰胺核苷激酶1的作用下生成NMN。NMN在人体内通过转化为NAD+来发挥其生理功能，如激活NAD+底物依赖性酶Sirt1(组蛋白脱乙酰酶，又称沉默调节蛋白)、调节细胞存活和死亡、维持氧化还原状态等。近期研究发现，通过补充NMN可以明显提高体内的NAD+水平，对心脑血管疾病、神经退行性病及老化退行性疾病等有较好的治疗和修复作用，还可以调节内分泌，起到保护和修复胰岛功能，增加胰岛素的分泌，对糖尿病和肥胖等代谢性疾病具有预防作用。

目前NMN的合成方法包括化学法和酶法。人们试图通过化学法来生产NMN，该方法通常是以烟酰胺核糖(NR)为原料，用三氯氧磷等进行磷酸化得到(Chem.Commun.1999,729-730，CN 107613990 A)，但所获产品杂质多、收率低、成本高，且涉及大量有毒有害试剂的使用，造成严重的环境污染，限制了其在食品级NMN的生产应用。现以酶法生产NMN成为了当前NMN生产的主流方式。例如，CN108026130A和CN110195089A公开了以烟酰胺、ATP和核糖为原料，在烟酰胺磷酸核糖转移酶、核糖磷酸焦磷酸激酶以及核糖激酶的催化作用下发生反应，制备烟酰胺单核苷酸；CN108949865A公开了以D-核糖-5-磷酸、ATP和烟酰胺为原料，通过固定化含有磷酸核糖焦磷酸合成酶和烟酰胺磷酸核糖转移酶的全细胞催化合成烟酰胺单核苷酸。CN106755209A公开了以烟酰胺核糖、ATP为底物，在烟酰胺核糖激酶的催化下生成烟酰胺单核苷酸；CN108026535A公开了以烟酰胺、ATP和AMP为原料，在烟酰胺磷酸核糖转移酶、核糖磷酸焦磷酸激酶以及核苷酶的催化作用下发生反应，制备烟酰胺单核苷酸。PCT/CN2016/092457发明公开了一种制备烟酰胺单核苷酸的方法，以烟酰胺、ATP和木糖为原料，在烟酰胺磷酸核糖转移酶、核糖磷酸焦磷酸激酶、核糖-5-磷酸异构酶、核酮糖-3-磷酸异构酶、木酮糖激酶以及木糖异构酶的催化作用下发生反应，合成烟酰胺单核苷酸。

上述专利文献用到的原料中，烟酰胺核糖暂无酶法直接制备的方法，需化学法合成，价格昂贵且不易购买，D-核糖-5-磷酸性质不稳定，价格也昂贵；而以廉价D-核糖为原料的专利中，需经核糖激酶、烟酰胺磷酸核糖转移酶和核糖磷酸焦磷酸激酶等多步反应合成NMN，转化率低(50％左右)、纯化困难、成本高；本发明首次揭示了磷酸核糖激酶的双层功能，即对核糖-1-磷酸具有解磷酸作用和对烟酰胺核糖具有磷酸化作用，在该酶的上述作用下，可以将核糖-1-磷酸、烟酰胺和ATP一步合成NMN，进而有了本发明的全新NMN合成路线，即以D-核糖、烟酰胺、ATP为底物，在核糖激酶、磷酸核糖变位酶及烟酰胺核糖激酶的偶联催化作用下，一锅法合成得到烟酰胺单核苷酸，该方法转化率高(大于90％)、收率高(大于80％)、成本低，适用于大规模化工业生产。

发明内容