[发明专利]一种细胞内5-醛基尿嘧啶的可视化分析方法及系统

说明书

本发明公开了一种细胞内5‑醛基尿嘧啶的可视化分析方法及系统，属于有机合成、分析化学及细胞成像领域。包括：合成生物正交ATP试剂ATP‑γ‑炔基；酶化学反应完全封闭细胞内本身存在的5‑羟甲基尿嘧啶；化学还原细胞内5‑醛基尿嘧啶为5‑羟甲基尿嘧啶；通过特异性酶识别和点击化学反应将DNA引物连接到5‑醛基尿嘧啶上；通过滚换扩增放大荧光信号，实现细胞内5‑醛基尿嘧啶的单分子可视化分析。解决了现有技术中无法特异性检测细胞内5‑醛基尿嘧啶的技术缺点。

技术领域

本发明属于细胞成像技术领域，涉及一种细胞内5-醛基尿嘧啶的可视化分析方法及系统。

背景技术

核酸的表观修饰在生命活动中起重要作用，全面了解天然碱基的修饰对于剖析表观遗传调控至关重要。近年来，现有技术文献报道了一种新型的表观遗传标记5-醛基尿嘧啶(简称5fU)，5-醛基尿嘧啶存在于许多细胞和组织中，可由紫外暴露、电离辐射产生；DNA上5-醛基尿嘧啶修饰会导致基因错配、改变DNA结构、引起DNA功能扰动。由于这些修饰丰度低(小鼠胚胎干细胞内5-醛基尿嘧啶丰度为2.5x10^-6dN)以及碱基结构的相似性，导致建立特异性的5fU检测方法极其困难。Zhou等人通过叠氮修饰的苯并咪唑-2-乙腈实现了小鼠海马组织中5fU的分离测序。基于测序的检测方法需要大量细胞样品，且只能得到细胞群体的平均值信息，无法反映单细胞水平差异，亦不能提供亚细胞空间分布特征。

细胞原位荧光成像可以在单细胞水平检测生物分子的亚细胞分布。抗体标记的细胞免疫荧光成像已被用于检测5-甲基胞嘧啶(5mC)、5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)等高丰度DNA修饰。然而，该类方法灵敏度不足，不适用于低丰度的5-醛基尿嘧啶检测。滚环扩增反应是一种靶点等温扩增方法，通过触发环状模板滚动产生具有周期性序列的长链DNA，实现荧光信号放大。前期，申请人团队基于滚环扩增反应，实现了微流控液滴中5-羟甲基尿嘧啶的单分子成像分析；但是，在该工作中，公开了5-羟甲基尿嘧啶DNA激酶(5-羟甲基尿苷DNA激酶)利用ATP底物对5-羟甲基尿嘧啶的特异性磷酸化标记。由于是以巯基修饰的ATP-γ-S作为底物，且由于细胞内存在大量巯基蛋白，ATP-γ-S不能用于细胞原位基因组识别。

因此，当前亟需能够实现细胞内5-醛基尿嘧啶的可视化分析方法。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种细胞内5-醛基尿嘧啶的可视化分析方法及系统，解决了现有技术中无法特异性检测细胞内5-醛基尿嘧啶的技术困难。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明公开的一种细胞内5-醛基尿嘧啶的可视化分析方法，包括：

封闭细胞内自身存在的5-羟甲基尿嘧啶；

将细胞内的5-醛基尿嘧啶还原为5-羟甲基尿嘧啶；

通过特异性酶识别和点击化学反应将DNA引物连接到5-羟甲基尿嘧啶上；

通过滚换扩增放大荧光信号，实现细胞内5-醛基尿嘧啶的单分子可视化分析。

优选地，通过酶化学反应封闭细胞内自身存在的5-羟甲基尿嘧啶是利用5-羟甲基尿苷DNA激酶将ATP结合在5-羟甲基尿嘧啶位点上。

进一步优选地，将细胞与20U 5-HMUDK和500μM ATP在1x Cutsmart缓冲液中于37℃孵育2小时。

优选地，采用硼氢化钠将细胞内5-醛基尿嘧啶还原为5-羟甲基尿嘧啶。

进一步优选地，用1mg/mL硼氢化钠将细胞内5-醛基尿嘧啶还原为5-羟甲基尿嘧啶，避光室温下反应5分钟。

优选地，通过特异性酶识别和点击化学反应将DNA引物连接到5-醛基尿嘧啶上，具体操作如下：