[发明专利]一种2’-岩藻糖基乳糖的分批发酵方法

说明书

本发明公开了一种2'‑岩藻糖基乳糖的分批发酵方法,该方法在原有基础上更适用于大规模发酵，生产效率和最终产量更高，更易于工业扩大培养，具有较高的应用前景和经济价值。本发明使用的发酵培养基组分简单，无有毒有害成分，经济廉价且易于获得，并且能得到较优的发酵效果和较高的2'‑岩藻糖基乳糖产量。

技术领域

本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种2’-岩藻糖基乳糖的发酵罐分批发酵方法。

背景技术

2’-岩藻糖基乳糖(2’-Fucosyllactose，2’-FL)是母乳低聚糖中含量最高的一种，其分子量为488.44Da。它通过α1-2糖苷键连接岩藻糖残基和乳糖的半乳糖端，是一种十分特殊的天然三糖。2’-FL作为一种中性寡糖，可以抵御人体胃肠道酶类的消化作用，因此它可以直接到达人体的结肠部位，被人体肠道的微生物消化分解，促进相关有益菌的增殖，起到益生元的作用。

近年来，大量研究表明，口服2’-FL可调节乳鼠的免疫功能，减轻炎症，增强肠屏障功能，降低过敏反应，甚至提高小鼠的认知能力。此外，研究还表明2’-FL对病原体感染具有保护作用。此外，2015年和2016年，FDA和欧盟也相继批准将2’-FL添加到婴幼儿配方奶粉中，甚至作为膳食补充剂和新型食品。商业上，也有许多公司在婴儿配方奶粉中添加了2’-FL，试图缩小配方奶粉和母乳之间的差距。但由于2’-FL只在母乳中发现大量存在，而其他哺乳动物中存在痕量或完全没有，只能通过人工合成的方式来获取，所以造价昂贵且安全性堪忧。因此，安全大量的获取2’-FL是业内一直以来探索的热点。目前2’-FL主要的合成途径有三种，化学合成，酶法合成以及微生物合成。Craft等人在2017年用化学法合成了多种母乳寡糖，其中包括2’-FL，但其步骤繁琐，副产物复杂，且产量不高；Alberman等率先于2001年用酶法合成了2’-FL，Choi等用双酶法从甘露糖合成2’-FL，但生产条件苛刻，且工具酶生产本身就需要复杂的生产过程，且价格不菲；微生物合成生产的2’-岩藻糖基乳糖，相对于其他生产方法其产能高，易扩大，更安全，Lee等就于2012年利用大肠杆菌生产出了2’-FL，其产量高达1.2g/L，近年来也有国内外其他团队被报道超过此产量，但相对于其他功能性聚糖动辄数百克每升的产量，2’-FL的产量还需要很大的上升空间。

对于生物法合成2’-FL，除了大肠杆菌系统外，还有大量其他工程菌系统。Yu等于2018年也利用酿酒酵母生产2’-FL，其产量达0.5g/L。另外也有通过构建枯草芽孢杆菌和谷氨酸棒杆菌来生产2’-FL的，但因为其体系复杂且不稳定，产量远不如大肠杆菌体系。因此，就目前技术而言，探究一种高效生产2’-FL的大肠杆菌发酵工艺，对2’-FL的生产应用以及科学研究是极其必要的。

发明内容

简言之，本发明总体上披露了一种利用大肠杆菌E.coli-XYY1生产2’-岩藻糖基乳糖的发酵罐分批发酵方法，该方法简单易操作，产量稳定且较现有方法产量更高，更稳定。为了达到上述目的，本发明提供的技术方案是：

一种2’-岩藻糖基乳糖的分批发酵方法，由如下步骤组成：

1)制备一级种子发酵液：取-80冰箱冻藏甘油株大肠杆菌，按体积百分比1-5％接种量接种于LB培养基中，37℃220rpm摇床培养4-8h；

2)制备二级种子发酵液：取一级种子发酵液按体积百分比5-10％接种量接种于LB培养基中，37℃220rpm摇床培养3-6h；

3)分批发酵：配制培养基灭菌后，按体积百分比10-20％接种量取二级种子发酵液接种，37℃400-600rpm搅拌，通气0.8-1.5vvm，恒定pH 7.0，(通过发酵罐的恒定pH模式，自动添加酸碱液，碱液为25％氨水，酸液为10％磷酸)，发酵4-6h后加入诱导剂0.2mM，随后温度设置为30℃，搅拌速度降为300-400rpm，通气量降至0.5-1vvm，添加诱导剂2-4h后添加底物乳糖至10-15g/L，添加消泡剂0.05mL/L，持续发酵96h后结束。

优选的，所述分批发酵在摇瓶或发酵罐中完成。