[发明专利]BCR-ABL1突变基因T315I的荧光检测方法及其用途

说明书

本发明属于核酸检测技术领域，公开了一种BCR‑ABL1突变基因T315I的荧光检测方法及其用途，BCR‑ABL1突变基因T315I的荧光检测方法包括：环状DNA模板的制备；DNAzyme特异性识别剪切反应；T4PNK特异性修饰；滚环扩增反应介导信号放大。本发明通过脱氧核酶DNAzymes特异性识别剪切、T4多核苷酸激酶T4PNK特异性修饰、滚环扩增反应RCA介导信号放大，成功构建了可用于T315I mRNA特异性检测的荧光方法，应用本发明策略对T315IRNA的测定，灵敏度高，重现性和稳定性好，能够满足早期临床诊断治疗、指导用药的要求，实现T315I突变基因的准确、快速检测。

技术领域

本发明属于核酸检测技术领域，尤其涉及一种BCR-ABL1突变基因T315I的荧光检测方法及其用途。

背景技术

目前，慢性粒细胞白血病(Chronic myeloid leukemia，CML)是一种影响血液及骨髓的恶性肿瘤，大约95％的CML患者会出现9号染色体和22号染色体长臂之间的染色体易位，即t(9；22)(q34；q11)产生的费城染色体(Ph)。染色体易位的结果是基因重新组合形成特异性的BCR-ABL融合基因，导致下游一系列信号通路过度活化表达，引起细胞恶性增殖。选择性的BCR-ABL酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibition，TKI)是治疗CML的重要手段，但是，ABL激酶结构域发生突变或其他原因会导致肿瘤耐药。其中，T315I突变是最重要的突变之一，一旦出现T315I突变，患者对现有的一、二代TKIs均耐药，预后极差。因此，尽早检出T315I突变对指导CML患者下一步用药及治疗，改善预后具有重要意义。

目前，基于聚合酶链式反应(Ranscription-polymerase chain reaction，PCR)的实时荧光定量聚合酶链式反应(q-PCR)和逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)是临床检验BCR-ABL融合基因的常用技术。但RT-PCR只能定性，不能定量检测靶标分子，并且可能会因为RNA的降解造成假阴性，误导临床诊断。q-PCR技术克服了RT-PCR的缺陷，可以准确定量检测，但因为敏感性极高，存在一定的假阳性率。另外，PCR检测的普遍缺点是过程繁琐，体系复杂，耗时长、成本高。荧光原位杂交(FISH)技术通过染色体上荧光信号的分布，能直观地判断相应靶标分子的表达情况。但FISH检测的操作过程比较复杂，容易因为前处理不当造成结果假阳性或假阴性。另外，FISH检测费用高，还需要专业的仪器设备，因此，很难在临床检验中大规模推广。近年来，生物传感技术日益发展，基于电化学，荧光共振转移等多种平台的BCR-ABL融合基因检测方法种类很多，但检测性能参差不齐，对T315I突变基因的鉴别能力有待考量。

因此，为满足早期临床诊断治疗、指导用药的要求，现有技术旨在建立一种高灵敏、高特异性的荧光检测方法，实现T315I突变基因的准确、快速检测。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：

(1)临床检验BCR-ABL融合基因的常用技术中，RT-PCR只能定性，不能定量检测靶标分子，并且可能会因为RNA的降解造成假阴性，误导临床诊断；q-PCR技术由于敏感性极高，存在一定的假阳性率；PCR检测过程繁琐，体系复杂，耗时长、成本高。

(2)FISH检测的操作过程比较复杂，容易因为前处理不当造成结果假阳性或假阴性。另外，FISH检测费用高，还需要专业的仪器设备，很难在临床检验中大规模推广。

(3)现有基因检测方法性能参差不齐，对T315I突变基因的鉴别能力有待考量。

解决以上问题及缺陷的难度为：

1)现有的突变检测多通过基因测序方法或Taqman突变检测分析方法实现，该类方法成本高，且需要特殊、高端的仪器设备，普通的检测实验室难以配备。2)DNAzyme对底物RNA的特殊识别需要严格的碱基互补配对作用，后续的滚环扩增反应中，剪切引物同滚环模板之间需要严格的碱基互补配对。