[发明专利]BCR-ABL1突变基因T315I的荧光检测方法及其用途

权利要求书

1.一种BCR-ABL1突变基因T315I在慢性粒细胞白血病检测中的用途。

2.一种BCR-ABL1突变基因T315I的荧光检测方法，其特征在于，所述BCR-ABL1突变基因T315I的荧光检测方法包括：

(1)在均相反应体系中，当T315I基因存在时，用连接DNAzyme的两个部分酶片段，在Mg²⁺存在的条件下，激活DNAzyme的剪切活性，将T315I基因剪切为两段裂解产物f1和f2，并在f1和f2的剪切位点分别产生3’端2’3’-环磷酸二酯末端和5’端羟基末端；

(2)利用T4 PNK酶进行修饰，切除f1的2’3’-环磷酸二酯末端并引入3’-OH末端，经T4PNK修饰过的f1命名为f1’；

(3)反应过后，f1’片段可以当作引物，引发滚环扩增反应；在phi29 DNA聚合酶的作用下，RCA反应产生大量含重复序列的单链DNA；

(4)RCA产生的单链DNA与体系中存在的拉链探针发生链置换反应，单链DNA与携带荧光基团的D-oligo完全互补，置换出游离C-oligo，导致荧光信号的产生，通过检测荧光信号强度即可获知T315I基因的量。

3.如权利要求2所述的BCR-ABL1突变基因T315I的荧光检测方法，其特征在于，所述BCR-ABL1突变基因T315I的荧光检测方法包括以下步骤：

步骤一，环状DNA模板的制备；

步骤二，DNAzyme特异性识别剪切反应；

步骤三，T4 PNK特异性修饰；

步骤四，滚环扩增反应介导信号放大。

4.如权利要求3所述的BCR-ABL1突变基因T315I的荧光检测方法，其特征在于，步骤一中，所述环状DNA模板的制备，包括：

(1)将浓度为2μM的5’端磷酸化后的线性DNA模板Cir-DNA和浓度为6μM的连接模板Ligation混合于1×T4 DNA连接缓冲液中，加热至90℃反应5min，随后缓慢冷却至室温，使Cir-DNA和Ligation之间进行杂交反应；

(2)向反应液中加入3.5U/μL的T4 DNA连接酶，充分混匀，于16℃孵育16h完成连接反应；反应后温度升至65℃保持10min，使连接酶失去活性；

(3)向反应产物中加入0.25U/μL的Exo I和5U/μL的Exo III，于37℃孵育5h以消化未成环的单链DNA或非特异性杂交的双链DNA，反应结束后温度升至80℃孵育20min使外切酶失去活性；

(4)反应结束后，环状DNA模板制备完成，4℃下可保存1月。

5.如权利要求4所述的BCR-ABL1突变基因T315I的荧光检测方法，其特征在于，所述1×T4 DNA连接缓冲液包括：100mM氯化镁，400mM Tris-盐酸，5mM ATP，100mM DTT，pH 7.8。

6.如权利要求1所述的BCR-ABL1突变基因T315I的荧光检测方法，其特征在于，步骤二中，所述DNAzyme识别剪切反应，包括：

(1)反应液配制：2μM DNAzyme探针，2U/μL的RNase抑制剂混合于1×缓冲液中；

(2)识别剪切反应：将不同浓度的T315I分子添加至上述反应液中，最终体积为10μL，充分混合后于37℃孵育30min；随后利用pH 8.0的乙二胺四乙酸盐调节浓度，使其终浓度为30mM，终止剪切反应。

7.如权利要求6所述的BCR-ABL1突变基因T315I的荧光检测方法，其特征在于，所述1×缓冲液包括：10mM Tris-盐酸，100mM氯化镁，100mM氯化钾，0.01mg/mL BSA。

8.如权利要求1所述的BCR-ABL1突变基因T315I的荧光检测方法，其特征在于，步骤三中，所述T4 PNK修饰，包括：

将0.5μL浓度为0.5U/μL的T4 PNK加入至催化剪切反应的产物中，此时反应液最终体积为10.5μL，充分混合后于37℃孵育30min。