[发明专利]一种萎缩性肌强直蛋白激酶基因CTG区域的PCR检测试剂盒及应用

说明书

本发明提供了一种萎缩性肌强直蛋白激酶基因CTG区域的PCR检测试剂盒，包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的特异性引物对。该方法具有扩增特异性强、扩增偏好性小的特点。同时克服了现有方法对部分样本检测显示假阴性的技术难点，实现了超过1000次重复变异的检测。本发明还提供了一种萎缩性肌强直蛋白激酶基因CTG区域的PCR检测试剂盒的应用。采用本发明的PCR检测试剂盒可以对携带CTG重复扩张的杂合等位基因样本进行扩增，同时可以用于检测萎缩性肌强直蛋白激酶基因3’‑UTR的CTG三碱基重复次数。

技术领域

本发明属于PCR扩增技术领域，具体地说，是关于一种萎缩性肌强直蛋白激酶基因CTG区域的PCR检测试剂盒及应用。

背景技术

强直性肌营养不良1型(Myotonic Dystrophy Type 1,DM1)是一种遗传性疾病，其主要以肌无力、肌强直、肌萎缩为特征，同时还伴有内分泌、心脏、眼部晶状体等其他系统损害。目前已知DM1是由DMPK基因3’-UTR区域CTG三碱基重复扩张所引起的，且DMPK基因中CTG重复次数从5次到5000次不等。

用于DMPK基因中CTG重复次数的测定的PCR扩增方法众多，如三重引物PCR(TP-PCR)、热脉冲PCR(HPE-PCR)、Small-pool-PCR(SP-PCR)以及Flash-small-pool PCR(FSP-PCR)。这些方法相对非扩增的southern-blot和三代测序来说，具有样本用量少、耗时短、成本可控等优点。但是PCR扩增的方法本身受引物本身的结构、与模板的结合牢固程度、目的基因片段大小等因素的影响，使得结果产生明显差异。而绝大部分情况下DM1患者的DMPK两个等位基因中CTG重复次数为一大一小，目前已知的引物绝大多数都具有偏好性，即倾向于扩增小片段，导致大片段的检测困难。

目前比较成熟的技术TP-PCR，但是，其只能检测出240次以内的CTG重复次数明确值，对于重复次数较大的情况(240次重复)还不能准确的给出重复次数(如中国专利文献201410211499.0公开的一组检测CTG重复序列的引物及其检测试剂盒)。此外，近年来有文献报道(Musova Z,Mazanec R,Krepelova A,et al.Highly unstable sequenceinterruptions of the CTG repeat in the myotonic dystrophy gene[J].2009,149A(7):1365-1374.)，TP-PCR方法虽然灵敏度和特异度均较高，但是约5％的假阴性样本，可能原因包括：1)重复序列中存在CCG/CTC和GGC等干扰序列；2)TP-PCR特异性引物与某些样本的结合区域存在突变；3)扩增过程中的某些偶发因素。

发明内容

本发明针对现有的DM1基因诊断技术的不足，提供了一种基于常规PCR技术的萎缩性肌强直蛋白激酶基因CTG区域的PCR检测试剂盒，该PCR检测试剂盒对于DMPK基因中CTG重复次数检测有明显优势，弥补了TP-PCR的不足，可实现重复次数大于240次的样本的扩增，并可通过测算给出这些样本DMPK基因中CTG的重复次数。同时该方法具有检测所需样本量较少、检测成本相对较低、检测结果直观、针对性强、灵敏度高、准确性高、可以检测出更多次数的重复变异等优点。为此，本发明的第一个目的是提供一种萎缩性肌强直蛋白激酶基因CTG区域的PCR检测试剂盒。本发明的第二个目的是提供一种所述的萎缩性肌强直蛋白激酶基因CTG区域的PCR检测试剂盒的应用。本发明的第三个目的是提供一种非疾病诊断目的的萎缩性肌强直蛋白激酶基因CTG区域的PCR检测方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

作为本发明的第一个方面，一种萎缩性肌强直蛋白激酶基因CTG区域的PCR检测试剂盒，包括特异性引物，所述特异性引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。