[发明专利]一种鉴定番茄颈腐基腐病抗性基因Frl检测的方法

说明书

本发明公开了一种鉴定番茄颈腐基腐病抗性基因Frl检测的方法。它是采用一组特异性引物对番茄颈腐基腐病抗性基因进行鉴定。该方法利用HRM开发出一种操作简单的分子标记方法来检测番茄颈腐根腐病的抗性基因。该方法不需酶切和电泳，只需利用HRM曲线就可区分出番茄颈腐根腐病抗感性。本方法可加快抗病育种进程，对推进蔬菜产业可持续发展具有重要意义。

技术领域

本发明提供一种快速、简捷、高效的番茄颈腐基腐病抗性基因的方法，属植物保护领域。

背景技术

近年来随着设施番茄栽培面积的不断扩大、频繁引进国外品种及主栽品种的更换，使得番茄颈腐基腐病在一些番茄种植基地流行为害逐年偏重。目前在生产上推广的很多番茄品种都表现出对番茄颈腐基腐病（Fusarium crown and root rot，FCRR）的高度感病性，且感病后发病速度快，死苗率非常高，给农户造成严重的经济损失。因此，积极开展番茄颈腐基腐病抗性鉴定工作和抗病育种研究工作，对减少该病害具有重要意义。

番茄颈腐基腐病是一种极具为害的土传病害，由尖孢镰刀菌FORL（Fusarium oxysporum f. sp. Radicis-lycopersici）引起。番茄颈腐基腐病抗源来自于野生番茄Solanum peruvianum(PI126944、PI128650、PI126926)，现已将抗病基因转入栽培番茄中。有研究表明，番茄颈腐基腐病抗性遗传受显性单基因Frl控制，且该基因位于9号染色体的长臂上。

前人已经对番茄颈腐基腐病的抗性遗传规律及分子标记进行了一些研究。Fazio等（1999)利用RAPD技术开发了一个抗番茄颈腐根腐病的标记UBC 194。然而，Tanyolac(2010)的研究结果则表明UBC 194不能准确地标记Frl基因的存在，并且表明RAPD技术区分不出杂合型和纯合型，该技术在育种中的应用存在局限性。

Staniaszek（2014）等人以保守序列位点C2-At2的8025为基础开发了一个CAPS标记，该标记与Frl紧密连锁，同时研究表明该序列位于番茄9号染色体45cM的位置上。目前番茄的抗颈腐基腐病的育种中大多应用的是该CAPS标记。但在操作的过程中，CAPS标记需要先进行PCR扩增及电泳再进行酶切。该方法成本高，过程繁琐，难以实现高通量检测。

本研究就是在Staniaszek等人的CAPS标记基础上，利用HRM方法开发出一种操作简单的分子标记方法来检测番茄颈腐基腐病的抗性基因（Frl）。该方法不需要电泳和酶切，只需利用HRM曲线就可检测出番茄中是否存在Frl基因。本方法可加快抗病育种进程，对推进蔬菜产业可持续发展具有重要意义。

发明内容

目前在番茄颈腐根腐病的抗性基因（Frl）检测方法中，需要进行电泳和限制性内切酶酶切等步骤。针对该方法检测时间太长且过程繁琐，难以实现高通量检测等问题，发明人进行了大量的研究工作，通过基因克隆和测序确定了抗感品种中的基因差异，利用HRM方法建立了番茄颈腐基腐病的抗性基因的检测体系。此方法无电泳和酶切，操作简单是一种简单方便的番茄颈腐基腐病的抗性基因（Frl）检测的新方法。

本发明旨在提供一种简便的抗性基因检测方法，通过该方法能科学高效准确地检测出番茄颈腐基腐病的抗性基因，为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容：

一种鉴定番茄颈腐基腐病抗性基因的特异性引物，特异性引物如下：

HRMC2F4: GGTACAGTATCAGTATGTCATCC

HRMC2R4：CACAAATCCTTATCTCTCTC。

本发明进一步公开了采用特异性引物进行番茄颈腐基腐病抗性基因（Frl）鉴定的方法，其特征在于按如下步骤进行：

（1）材料：待检测的番茄种子

（2）方法

1）育苗将番茄种子播于育苗盘中每穴2粒，常规管理，待到2片真叶时进行检测；