[发明专利]一种鉴定番茄颈腐基腐病抗性基因Frl检测的方法

权利要求书

1. 一种鉴定番茄颈腐基腐病抗性基因的特异性引物：

HRMC2F4: GGTACAGTATCAGTATGTCATCC

HRMC2R4：CACAAATCCTTATCTCTCTC。

2.采用权利要求1所述的特异性引物进行番茄颈腐基腐病抗性基因Frl检测的方法，其特征在于按如下步骤进行

（1）材料：待检测的番茄

（2）方法

1）育苗将番茄种子播于育苗盘中每穴2粒，常规管理，待到2片真叶时进行检测；

2）DNA提取：采用CTAB法进行DNA提取；

3）HRM扩增

HRM分析的引物对：

HRMC2F4:GGTACAGTATCAGTATGTCATCC

HRMC2R4：CACAAATCCTTATCTCTCTC

PCR 扩增和高分辨率熔解曲线分析在Quantstudio 3荧光定量PCR 仪上进行，反应总体积为20μL，包括模板DNA 20-60 ng，premix 10uL，20×Evagreen 1uL, 5^，端引物（10µmol/L）0.4μL，3^，端引物（10µmol/L ）0.4μL；

PCR 扩增程序：95 ℃预变性10 min，然后按95 ℃变性10 min，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s 进行45 个循环；

扩增产物HRM 检测程序为：95 ℃ 1 min，40 ℃ 1 min，65 ℃ 1 s，在65 ℃升温至95℃的过程中，以25 次·℃^-1 的频率收集荧光信息，最后降温至40 ℃，利用HRM软件（Version3.1）进行高分辨率熔解曲线分析。

3.权利要求2所述番茄颈腐基腐病抗性基因Frl检测方法在准确区分出番茄颈腐基腐病抗感性方面的应用。