[发明专利]羧酸还原酶重组质粒及其构建方法和应用

说明书

本发明公开一种羧酸还原酶重组质粒，该重组质粒通过将羧酸还原酶基因和磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因连接到pRSFDuet‑1载体上得到。本发明进一步提出了包含该重组质粒的重组菌，并进一步利用该重组菌生产羧酸还原酶SrCAR并应用于1，2‑丙二醇生产。本发明实现了生物制备1，2‑丙二醇的高效合成途径，具有很高的应用前景，利用上述羧酸还原酶SrCAR催化葡萄糖产1，2‑丙二醇，在未对大肠杆菌菌株进行基因敲除的情况下，4h得到的1，2‑丙二醇产量是文献报道利用含有羧酸还原酶MavCAR的基因敲除大肠杆菌菌株合成1，2‑丙二醇产量的4‑5倍。

技术领域

本发明涉及基因工程和微生物技术领域，具体涉及羧酸还原酶重组质粒及其构建方法和应用。

背景技术

传统化学法催化羧酸到醛的还原反应，不仅需要贵金属作为催化剂，而且存在反应条件极端、对相邻官能团的耐受性差、产生副反应等缺点。羧酸还原酶(Carboxylic acidreductase,CAR,EC 1.2.1.30和EC 1.2.1.31)是一类广泛分布于细菌、真菌及部分植物体内的多功能酶，可高效催化由羧酸到醛的化学反应，利用羧酸还原酶生物还原羧酸为相应醛，不仅反应条件温和、底物谱宽泛、针对性强，可专一识别羧酸基团，还能解决化学合成法产生的环保压力和能源问题，显著降低生产过程中的资源与能源消耗。羧酸还原酶还可与醇脱氢酶形成级联反应生成醇类等具有高附加值的下游化合物，可用于添加剂、清洁能源、精细化工及生物医药等领域。具有重要的研究意义及广阔的市场应用前景。

1，2-丙二醇是一种商品化学品，全球需求量约为136万吨/年。1，2-丙二醇主要用于不饱和聚酯树脂、液体洗涤剂、药品、化妆品、防冻剂和除冰剂。生物法制备1， 2-丙二醇的方法主要涉及葡萄糖的糖酵解代谢，在此途径中糖酵解中间体磷酸二羟丙酮首先被脱磷酸化为丙酮醛，丙酮醛随后被还原为D-乳醛和羟基丙酮，D-乳醛最后被还原为R-1，2-丙二醇。该工艺的主要缺点在于丙酮醛等有毒中间体的存在对细胞有所损害，合成途径相对复杂，工业化生产受限。

因此，寻求能够高效转化D-乳酸合成1，2-丙二醇的羧酸还原酶，不仅对于提供 1，2-丙二醇生产工艺具有重要的作用，更重要的意义在于羧酸还原酶法制备1，2-丙二醇是一种简单高效的生物途径，且更贴合绿色化学的宗旨，对1，2-丙二醇的生物合成潜力有重大贡献。迄今为止，适用于D-乳酸合成1，2-丙二醇的羧酸还原酶制备与开发的报道很少，目前仅有一篇应用羧酸还原酶MavCAR还原乳酸合成1，2丙二醇的研究，且该羧酸还原酶在导入工程化大肠杆菌菌株后4h仅合成了不到1mM的R-1， 2-丙二醇，因此亟待寻找能高效还原乳酸合成1，2-丙二醇的羧酸还原酶。

发明内容

发明目的：为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种羧酸还原酶SrCAR的重组质粒、包含其的重组菌及其应用。

为实现上述目的，本发明提出了一种羧酸还原酶重组质粒，该重组质粒通过将羧酸还原酶基因和磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因连接到pRSFDuet-1载体上得到。

具体地，所述羧酸还原酶基因为编码羧酸还原酶SrCAR的基因，其核苷酸序列如SEQ NO.3所示，所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因为编码磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶Bssfp的基因，其核苷酸序列如SEQ NO.4所示。