[发明专利]一种利用烟草表达三七皂苷的方法

说明书

本发明公开一种利用烟草表达三七皂苷的方法，属于生物技术领域。本发明所述方法为：参照三七的基因组序列，在两端分别设计正反引物，克隆三七中的SS基因；将SS基因构建到植物表达载体pCAMBIA2300‑35S，并命名为pCAMBIA2300‑35S‑SS2‑1，将其转化到农杆菌EHA105中，利用农杆菌介导的方法把含SS基因的质粒转化烟草，当转基因烟草生长一段时间后采集叶片，用甲醇提取烟叶中的皂苷，对烟草叶片中单体皂苷Rb1,Rd,R1,Re,Rg1含量进行检测；结果显示，野生型烟草总未检测出皂苷，而在转基因烟草植株中检测到Rg1，Re，Rb1共3种单体皂苷。

技术领域

本发明涉及一种利用烟草表达三七皂苷的方法，属于生物技术领域。

背景技术

三七Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen是五加科人参属的草本植物，三七总皂苷是三七主要的药用活性成分，对治疗心脑血管疾病、胃肠道疾病、抑制癌细胞等方面效果显著。三七总皂苷为达玛烷型四环三萜皂苷，鲨烯是所有三萜皂苷及甾醇等萜烯类物质的共同前体，因此对于催化鲨烯合成的鲨烯合酶(squalene synthase,SS)基因的研究，有助于促进三七总皂苷的合成。鲨烯合酶(squalene synthase，SS)是生成三萜化合物和植物甾醇的前体，它的作用在于能使法呢基焦磷酸(farnesyldiphosphate，FPP)缩合生成鲨烯。增加植物中SS基因的含量和活性，能够有效促进植株中三萜皂苷的合成。有研究表明，过表达SS基因会使该途径下游其它酶的含量和活性增加，从而提高人参皂苷的产量。

随着组培技术和转基因技术体系逐渐成熟，烟草作为模式植物在生命科学研究领域发挥重要作用。并且烟草具有易培养、易种植、生长周期短、可收获大量种子等特点，十分有利于转化SS基因。转基因烟草还因其安全、环保，生长迅速的特性成为生产生物制品的理想载体，我们将皂苷合成关键酶基因转化烟草，希望利用烟草这个理想的生产生物制品的载体，可以大量提取三七皂苷。从而打破三七生产上的生长周期慢、易造成病害及连作障碍等制约三七皂苷生产的难题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用烟草表达三七皂苷的方法，具体包括以下步骤：

(1)参照三七的基因组序列，在两端分别设计正反引物，克隆三七中的SS基因序列如SEQ ID NO:1；

所述正反引物分别是SS FP：5’-ACGCGTCGACATGGGAAGTTTGGGGGCAATTC-3’，SSRP：5’-TGGTTCTGCAGTCACTGTTTGTTCGGTAGTAG-3’；

(2)将三七SS基因克隆到植物表达载体中，使三七SS基因在35S启动子及其它启动子的作用下进行基因转录与表达；

(3)利用三七完整或部分的SS基因(CDS序列及基因组序列)转化烟草，使三七SS基因在烟草包括烟草中表达进行皂苷合成。

本发明步骤(2)中所述所述植物表达载体为pCAMBIA2300，但并不限于pCAMBIA2300，其他满足要求的植物载体也可用于本发明。

将SS基因构建到植物表达载体pCAMBIA2300-35S中，并命名为pCAMBIA2300-35S-SS2-1，将其转化到农杆菌EHA105中，利用农杆菌介导的方法把含SS基因的质粒转化烟草。