[发明专利]一种利用烟草表达三七皂苷的方法

权利要求书

1.一种利用烟草表达三七皂苷的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

(1)参照三七的基因组序列，在两端分别设计正反引物，克隆三七中的SS基因序列如SEQ ID NO:1；

所述正反引物分别是SS FP：5’-ACGCGTCGACATGGGAAGTTTGGGGGCAATTC-3’，SS RP：5’-TGGTTCTGCAGTCACTGTTTGTTCGGTAGTAG-3’；

(2)将三七SS基因克隆到植物表达载体中，使三七SS基因在35S启动子及其它启动子的作用下进行基因转录与表达；

(3)利用三七完整或部分的SS基因转化烟草，使三七SS基因在烟草包括烟草中表达进行皂苷合成。

2.根据权利要求1所述利用烟草表达三七皂苷的方法，其特征在于：步骤(2)中所述所述植物表达载体为pCAMBIA2300。

3.根据权利要求2所述利用烟草表达三七皂苷的方法，其特征在于：将SS基因构建到植物表达载体pCAMBIA2300-35S中，并命名为pCAMBIA2300-35S-SS2-1，将其转化到农杆菌EHA105中，利用农杆菌介导的方法把含SS基因的质粒转化烟草。

4.根据权利要求2或3所述利用烟草表达三七皂苷的方法，其特征在于：表达载体pCAMBIA2300-35S的构建方法为：先将35S-GFP-terminator插入pCAMBIA2300载体上，插入多克隆位点5’EcoRI/HindIII 3’之间；构建pCAMBIA2300-35S-GFP载体，再用5’SalI--PstI3’切开GFP部分，插入SS基因替换原载体的GFP基因。

5.根据权利要求3所述利用烟草表达三七皂苷的方法，其特征在于：步骤(2)利用农杆菌介导的方法把含SS基因的质粒转化烟草的具体过程为：在超净工作台将烟叶剪成0.5cm²大小，放入农杆菌浸染液中浸泡3min，取出烟叶，用滤纸吸取多余浸染液后，将叶片转入含有0.5mg/L浓度的6-BA培养基上，黑暗培养3天；经过黑暗培养的烟叶转入含有为500mg/L羧苄青霉素的MS培养基上，25℃±1℃，光照培养30至45天；形成愈伤组织后，嫩芽陆续从中长出，将组织整体转入含有羧苄青霉素和浓度为50mg/L卡那霉素的MS选择压培养基上，25℃±1℃，光照培养7至10天；经过筛选后，继续生长的烟芽从愈伤组织上分离下来，转至生根培养基中，25℃±1℃，光照培养；生根的烟草苗长至4-5cm高，有3到4片小叶时就可炼苗移栽。