[发明专利]BeSO4

说明书

BeSO₄染毒大鼠肺组织差异表达蛋白检测与分析方法，步骤如下：1、获取大鼠肺组织；2、样品制备；3、蛋白还原处理；4、蛋白烷基化处理；5、蛋白酶解；6、对蛋白进行TMT标记；7、对样品进行LC‑MS/MS检测；8、GO和KEGG富集分析；9、PPI网络图分析。本发明利用TMT标记的定量蛋白质组学技术和生物信息学分析技术，一方面实现了快速且高通量的检测BeSO₄染毒大鼠肺组织的蛋白表达情况，另一方面实现了快速且准确的从大鼠肺组织中筛选出关键蛋白，为BeSO₄致肺细胞损伤的发生机理指明了研究方向，对诊断和治疗“铍肺”具有重大指导意义。

技术领域

本发明涉及肺部疾病实验研究领域，特别是一种BeSO₄染毒大鼠肺组织差异表达蛋白检测与分析方法。

背景技术

铍(Beryllium，Be)是一种灰白色碱土金属，具有较高的熔点及较强的导电性和导热性，其主要以铍金属、铍合金和铍氧化物这三种形式使用，广泛用于航空航天、信息技术、医疗行业和核工业。

铍早在1993年就被国际癌症研究机构列为Ⅰ类致癌物，暴露于铍化合物中可致急性铍病、铍致敏、慢性铍病、肺癌疾病。铍暴露(即暴露在含有铍化合物的环境中)会损伤全身多处脏器。而肺脏是铍损害的主要靶器官，铍对肺脏的损害可以引起呼吸系统炎症、肺组织肉芽肿及肺间质纤维化，造成肺组织的结构和功能损伤，形成“铍肺”。更加严重的问题是，在停止铍暴露多年后，铍仍会存在于个体的肺中，对肺脏形成持续的损害。

目前，铍化合物致肺损伤的毒理机制尚未完全阐明，针对“铍肺”的治疗也仅是对症及支持治疗为主。因此，深入了解铍化合物致肺损伤的毒理机制对于防治“铍肺”显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，而提供一种BeSO₄染毒大鼠肺组织差异表达蛋白检测与分析方法，其从分子领域探索了BeSO₄染毒大鼠肺组织的生物标志物，对后续探究铍化合物的毒作用机制，以及“铍肺”的诊断和治疗具有指导意义。

本发明的技术方案是：BeSO₄染毒大鼠肺组织差异表达蛋白检测与分析方法，步骤如下：

S01、获取大鼠肺组织：

a、选10只健康的雄性大鼠，随机分为5只一组的对照组和5只一组的染毒组，分别正常喂水喂食饲养6周，染毒组在第2周滴注0.25ml的BeSO₄溶液到大鼠气管中，对照组在第2周滴注0.25ml的灭菌超纯水到大鼠气管中；

b、染毒组和对照组共10只大鼠均用乙醚麻醉，再用腹主动脉采血法收集血液，待大鼠死亡后，分别取肺脏以待后续使用；

S02、样品制备：

a、每个肺脏分别称取50mg，分别剪碎,放入不同的无菌研钵体中，在每个无菌研钵体中加入300ul 8M urea裂解液和3ul蛋白酶抑制剂；

b、将10个无菌研钵体中的肺组织分别置于研磨仪中研磨成肉糜，静置30min，使肺组织中的蛋白质充分发生裂解反应；

c、将10份样品分别收集到10个离心管中，分别进行离心处理，离心处理后，分别收集10个离心管中的上清液，上清液中含有肺组织中的蛋白质；

d、分别测定10份上清液中的蛋白质浓度，根据每份上清液的蛋白质浓度，在10份上清液中分别取含有150ug蛋白质的溶液量，转移到不同的超滤管的内管中；

S03、蛋白还原处理：

a、在10个超滤管的内管中分别加入浓度为10mM的DTT溶液，将各超滤管中的溶液量补足至500ul，再对各超滤管进行离心处理，离心处理后，丢弃超滤管外管中的滤出液；

b、重复b分步骤至少两次，使裂解液被DTT充分置换掉；

c、将10个超滤管静置于37℃的孵育箱中避光孵育1h，使超滤管内管中的蛋白质与DTT充分发生还原反应；

S04、蛋白烷基化处理：