[发明专利]BeSO4

权利要求书

1.BeSO₄染毒大鼠肺组织差异表达蛋白检测与分析方法，其特征是：步骤如下：

S01、获取大鼠肺组织：

a、选10只健康的雄性大鼠，随机分为5只一组的对照组和5只一组的染毒组，分别正常喂水喂食饲养6周，染毒组在第2周滴注0.25ml的BeSO₄溶液到大鼠气管中，对照组在第2周滴注0.25ml的灭菌超纯水到大鼠气管中；

b、染毒组和对照组共10只大鼠均用乙醚麻醉，再用腹主动脉采血法收集血液，待大鼠死亡后，分别取肺脏以待后续使用；

S02、样品制备：

a、每个肺脏分别称取50mg，分别剪碎,放入不同的无菌研钵体中，在每个无菌研钵体中加入300ul 8M urea裂解液和3ul蛋白酶抑制剂；

b、将10个无菌研钵体中的肺组织分别置于研磨仪中研磨成肉糜，静置30min，使肺组织中的蛋白质充分发生裂解反应；

c、将10份样品分别收集到10个离心管中，分别进行离心处理，离心处理后，分别收集10个离心管中的上清液，上清液中含有肺组织中的蛋白质；

d、分别测定10份上清液中的蛋白质浓度，根据每份上清液的蛋白质浓度，在10份上清液中分别取含有150ug蛋白质的溶液量，转移到不同的超滤管的内管中；

S03、蛋白还原处理：

a、在10个超滤管的内管中分别加入浓度为10mM的DTT溶液，将各超滤管中的溶液量补足至500ul，再对各超滤管进行离心处理，离心处理后，丢弃超滤管外管中的滤出液；

b、重复b分步骤至少两次，使裂解液被DTT充分置换掉；

c、将10个超滤管置于37℃的孵育箱中1h，使超滤管内管中的蛋白质与DTT充分发生还原反应；

S04、蛋白烷基化处理：

a、在10个超滤管的内管中分别加入浓度为20mM的IAA溶液，将各超滤管中的溶液量补足至500ul；再对各超滤管进行离心处理，离心处理后，丢弃超滤管外管中的滤出液；

b、重复a步骤至少两次，使DTT被IAA充分置换掉；

c、将10个超滤管静置于37℃的孵育箱中避光静置1h，使超滤管内管中的蛋白质与IAA充分发生烷基化反应；

S05、蛋白酶解：

a、在10个超滤管的内管中分别加入浓度为100mM的TEAB溶液，将各超滤管中的溶液量补足至500ul；再对各超滤管进行离心处理，离心处理后，丢弃超滤管外管中的滤出液；

b、重复a步骤至少两次，使IAA被TEAB充分置换掉；

c、将10个超滤管内管中的溶液一一对应的转移至10个EP管中，分别添加胰蛋白酶至各EP管中，各EP管均于37℃的温度下进行酶解反应14-16h；

S06、对蛋白进行TMT标记：

使用TMT标签对酶解后的10个EP管内的溶液样品进行标记，每管样品使用一个标签，各EP管均置于37℃的孵育箱中进行标记反应1h，标记反应完成后，各EP管中分别加入8ul的5%质量浓度的羟胺溶液，静置15min，以终止标记反应；

S07、对样品进行LC-MS/MS检测：

a、将染毒组的5管样品混合为一管，命名为A管，将对照组的5管样品混合为一管，命名为B管，再分别对A管和B管内的溶液进行浓缩干燥，然后在A管和B管内分别加入200ul的0.1%FA溶解干燥浓缩后的样品，之后对A管和B管内的溶液分别进行分组分，各获得45管分馏样品，将所有的分馏样品浓缩蒸干以待后续试验使用；

b、将染毒组的45管浓缩蒸干样品分别命名为C₁、C₂、C₃·····C₄₅，在C₁- C₁₅号浓缩蒸干样品中分别加入20ul的0.1%FA进行溶解，然后用C₁号溶液依次溶解C₁₆号和C₃₁号样品，用C₂号溶液依次溶解C₁₇号和C₃₂号样品，用C₃号溶液依次溶解C₁₈号和C₃₃号样品，以此类推，用C₁₅溶液依次溶解C₃₀号和C₄₅号样品，最终得到15管染毒组的溶液，每管溶液中均包含3管浓缩蒸干样品的物质量；

c、将对照组的45管浓缩蒸干样品分别命名为D₁、D₂、D₃·····D₄₅，在D₁- D₁₅号浓缩蒸干样品中分别加入20ul的0.1%FA进行溶解，然后用D₁号溶液依次溶解D₁₆号和D₃₁号样品，用C₂号溶液依次溶解D₁₇号和C₃₂号样品，用D₃号溶液依次溶解D₁₈号和D₃₃号样品，以此类推，用D₁₅溶液依次溶解D₃₀号和D₄₅号样品，最终得到15管对照组的溶液，每管溶液中均包含3管浓缩蒸干样品的物质量；

d、将染毒组和对照组共30管溶液于质谱仪进行上机检测，针对检测数据使用UniProt人数据库进行搜索，获得包含蛋白种类、丰度信息和相对分子量的原始数据；

S08、GO和KEGG富集分析：

a、按照P value＜0.05、|FC|1.2的标准，通过Persue软件对原始数据进行筛选，找到差异表达蛋白；

b、基于R语言“clusterProfiler”及“org.Hs.eg.db”两个软件包对差异表达蛋白进行GO富集分析和KEGG富集分析，通过GO富集分析获取差异表达蛋白的生物学功能、分布位置和分子功能，通过KEGG富集分析获取差异表达蛋白参与BeSO₄致肺细胞损伤的信号途径；

c、基于KEGG富集分析的结果，从差异表达蛋白中筛选出与信号途径相关的差异表达蛋白，称为相关差异表达蛋白；结合信号途径对应的通路图，从相关差异表达蛋白中筛选出参与了信号途径的蛋白；

S09、PPI网络图分析：

a、将相关差异表达蛋白输入String在线数据库进行检索，将检索结果保存为TSV格式文件；

b、通过Cytoscape软件对TSV格式文件进行可视化分析，绘制出由相关差异表达蛋白组成的PPI网络图；

c、结合PPI网络图，从参与了信号途径的蛋白中筛选出关键蛋白，所述关键蛋白同时与至少2种蛋白具有相关性。