[发明专利]一种检测人羊膜上皮细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制方法

说明书

本发明涉及淋巴细胞增殖抑制领域，更具体地，本发明涉及一种检测人羊膜上皮细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制方法，其包括：人羊膜上皮细胞与染色后的PBMC细胞在含有游离氨基刺激剂存在的条件下在第一完全培养基中进行共培养后，记录淋巴细胞增殖能力。本申请检测人羊膜上皮细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制方法操作简单，数据稳定，相对标准偏差在5％以内，抑制率高达75％，可应用在免疫调节中。

技术领域

本发明涉及淋巴细胞增殖抑制领域，更具体地，本发明涉及一种检测人羊膜上皮细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制方法。

背景技术

羊膜细胞通俗地说就是包裹羊水的那层透明薄膜上的细胞，一张成熟的羊膜面积可达2平方米，聚集了3亿个羊膜上皮细胞。作为胚胎的保护层，羊膜不仅为胎儿发育提供营养，也是一道阻隔母体与胎儿两个异体组织互不排斥的奇妙屏障。

人羊膜上皮细胞存在于分娩后胎盘上的羊膜组织中，是由受精卵发育至第8天的囊胚内细胞团分化而来，具有分化潜能，可向3个胚层组织分化。在合适的诱导条件下，人羊膜上皮细胞可分化为肝细胞、心肌细胞、神经细胞等。它是一类具有干细胞特性的上皮细胞，表达干细胞标志分子及相关基因，如CD133，CD271，TRA-1-60，Oct3/4，SOX-2，SSEA4和Klf4，但不表达干细胞中的端粒酶基因。端粒酶可以保护染色体的末端，保证DNA不在复制过程中缩短，从而使细胞永生化。因此，人羊膜上皮细胞不能无限增殖，不能看做严格意义上的干细胞。细胞表面不表达HLA-A、B、C和DR抗原，因抗原性极低，同种异体移植后不会引起免疫排斥反应。

然而人羊膜细胞培养三天后才会进入对数生长期，繁殖缓慢，其对于淋巴细胞增殖抑制效果缓慢，同时由于细胞培养增殖、去增殖等方法存在差异，人羊膜细胞的质量也存在很大差异，在体外检测淋巴细胞增殖抑制时数据波动大，不稳定。

发明内容

针对现有技术中存在的一些问题，本发明第一个方面提供了一种检测人羊膜上皮细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制方法，其包括：人羊膜上皮细胞与染色后的PBMC细胞在含有游离氨基刺激剂存在的条件下在第一完全培养基中进行共培养后，记录淋巴细胞增殖能力。

作为本发明的一种优选的技术方案，所述检测人羊膜上皮细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制方法还包括：人羊膜上皮细胞接种：取人羊膜上皮细胞悬液，进行n次离心去上清后，使用完全培养基进行重悬，之后接种培养，n≥1。

作为本发明的一种优选的技术方案，所述检测人羊膜上皮细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制方法还包括：将接种培养的人羊膜上皮细胞去增殖后继续培养。

作为本发明的一种优选的技术方案，所述刺激剂在第一完全培养基中的终浓度为2.2-2.6μg/mL。

作为本发明的一种优选的技术方案，所述游离氨基刺激剂为anti-CD3和/或anti-CD28。

作为本发明的一种优选的技术方案，所述游离氨基刺激剂为anti-CD3和anti-CD28，其浓度比为1：(0.8-1.2)。

作为本发明的一种优选的技术方案，当n＝1时，所述完全培养基含有8-12wt％胎牛血清。

作为本发明的一种优选的技术方案，所述完全培养基为Gibco 1640培养基。

作为本发明的一种优选的技术方案，所述人羊膜上皮细胞接种过程中，接种培养的条件为：4.8-5.2vol％CO₂，温度为30-40℃，培养20-24h。

本发明第二个方面提供了一种所述检测人羊膜上皮细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制方法在免疫调节中的应用。

本发明与现有技术相比具有以下有益效果：

(1)本申请严格控制刺激剂的浓度，使得在接种培养人羊膜上皮细胞20-24h时与染色后的PBMC细胞共培养时，人羊膜上皮细胞与PBMC细胞接触几率增大；