[发明专利]基于宏蛋白质组学技术对浓香大曲进行酶系结构解析的方法

说明书

本发明属于宏蛋白质组学技术领域，具体涉及一种基于宏蛋白质组学技术对浓香大曲进行酶系结构解析的方法。针对目前还未见有对浓香大曲中酶种类和酶成分的具体解析的方法的问题，本发明提供了一种基于宏蛋白质组学技术对浓香大曲进行酶系结构解析的方法，通过建立浓香大曲粗酶液和宏蛋白质组样品的提取方法以及浓香大曲酶系结构的分析方法，实现了应用宏蛋白质组学对浓香大曲酶系组成的解析，解决了之前的研究缺少对浓香大曲未知酶系的深入解析的问题。本发明为白酒中风味物质的解析提供了理论基础，具有重要的意义。

技术领域

本发明属于宏蛋白质组学技术领域，具体涉及一种基于宏蛋白质组学技术对浓香大曲进行酶系结构解析的方法。

背景技术

白酒是全球消费量最大的烈性酒，它和伏特加、白兰地、威士忌被称为世界四大蒸馏酒。根据白酒风味特征的不同，可以将其分为三种主要类型：浓味白酒、酱味白酒和清香白酒。白酒的发酵采用的是沿用了几千年的固态糖化发酵工艺，这种工艺的核心在于它的发酵剂——酒曲，它的作用是为整个酿酒过程提供微生物和酶，而这些微生物和酶对于形成白酒中各种风味物质有着重要作用。酿造浓香白酒使用的酒曲是浓香大曲，行业内对于浓香大曲开展了很多研究，但是却没有实质性的揭示浓香大曲中酶系的组成。目前对于浓香大曲的研究主要集中在两个方面。第一，是集中在对浓香大曲的酶活检测上，通常是检测大曲中常见的酶类。第二，是关于浓香大曲中微生物群落动态解析上，这种是从微生物水平来解析浓香大曲的微生物组成及变化。但是，目前缺乏对浓香大曲中的酶种类和各种酶的酶活方面的进一步研究，还有待开发。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：目前还未见有对浓香大曲中酶种类和酶成分的具体解析的方法，无法从酶的水平去明确浓香大曲在白酒酿造中的作用。

本发明解决上述技术问题的技术方案为：提供一种基于宏蛋白质组学技术对浓香大曲进行酶系结构解析的方法。该方法包括以下步骤：

a、提取浓香大曲粗酶液并测定粗酶液中的各种酶活；具体的提取粗酶液的操作为：将浓香大曲破碎后，用Tris-HCL作为溶剂进行提取，大曲与Tris-HCL溶剂的加入量为液固比为1︰5～10，提取过程中的pH值为5.0～7.0，提取时间为0.5～2h；

b、提取宏蛋白样品并采用宏蛋白质组学技术进行解析；

提取的具体操作步骤为：在大曲样品中加入BPP提取液，震荡、离心后取上清液，加入同体积的Tris-饱和酚溶液，再次震荡离心获得含有蛋白的酚层，再加入相同体积的BPP提取液，震荡离心取上清液，加入等体积的乙酸铵甲醇溶液，-20℃过夜沉淀蛋白，在沉淀中加入丙酮，离心去上清，采用裂解液溶解蛋白，得到待测样品；

提取样品的酶解：将提取的蛋白，加入二硫苏糖醇，37℃孵育1h；冷却至室温，加入碘乙酰胺，室温放置30min；加入胰酶37℃恒温过夜，加入甲酸终止酶切，收集消化后的馏分，保存在-80℃下进行MS分析；

c、将宏蛋白质组学技术解析结果与酶活测定结果进行对比。

其中，上述基于宏蛋白质组学技术对浓香大曲进行酶系结构解析的方法中，步骤a中所述的酶包括：α-淀粉酶，蛋白酶，纤维素酶或果胶酶中的至少一种。

其中，上述基于宏蛋白质组学技术对浓香大曲进行酶系结构解析的方法中，步骤b中加入的大曲样品与BPP提取液的比例为0.4g︰1mL。

其中，上述基于宏蛋白质组学技术对浓香大曲进行酶系结构解析的方法中，步骤b中所述的裂解液为含有8M尿素的裂解液。

其中，上述基于宏蛋白质组学技术对浓香大曲进行酶系结构解析的方法中，步骤b中所述的二硫苏糖醇的终浓度为10mM。

其中，上述基于宏蛋白质组学技术对浓香大曲进行酶系结构解析的方法中，步骤b中所述的碘乙酰胺的终浓度为30mM。