[发明专利]一种利用纸芯片对基因组损伤位点数进行绝对定量的检测方法与应用

说明书

本发明公开了一种利用纸芯片对基因组损伤位点数进行绝对定量的检测方法与应用，属于分析检测领域。利用末端脱氧核苷酸转移酶TdT催化核酸标记荧光染料FITC‑dUTP聚合到DNA链3’‑OH的末端，并利用纤维素纸有限尺寸的孔道结构对聚合反应的程度进行有效控制，实现了TdT对DNA链3’‑OH末端的有限聚合。与溶液中聚合反应的均一性较差相比，纤维素纸孔道中的聚合反应更加均一，且聚合FITC‑dUTP的数量随孔径的减小而减小，聚合度不随DNA序列而改变，方法具有普适性。损伤的基因组可经DNA修复酶作用转化为3’‑OH断裂类型的损伤，在纤维素纸中对该末端进行荧光标记可实现绝对定量检测，同时利用该方法也可实现对细胞修复能力的评估。

技术领域

本发明属于分析检测领域，具体涉及一种利用纸芯片对基因组损伤位点数进行绝对定量的检测方法与应用。

背景技术

末端脱氧核苷酸转移酶TdT是一种不依赖于模板的DNA聚合酶，带有突出、凹陷或平滑末端的单双链DNA分子的3’-OH末端均可作为TdT的底物被重复添加脱氧核苷酸。可利用TdT能聚合脱氧核糖核苷酸特性作为检测DNA分子3’-OH断裂的一种潜在方法。

纤维素纸基器件因其便携、简单、便宜、多孔等特点广泛应用于核酸检测领域。一般超灵敏检测目标DNA的方法是利用模板依赖性的DNA聚合酶通过核酸扩增技术实现。但是这些方法不能对基因组随机位点的损伤进行有效的检测。

基因组有多种损伤形式，常见的有DNA分子3’-OH类型的断裂、DNA 3’-PO₄^-类型的断裂、碱基烷基化、碱基氧化、碱基脱氨基，这些损伤均可以利用细胞内碱基切除修复通路所涉及的DNA修复酶转化为DNA 3’-OH断裂类型。传统DNA损伤的检测方法步骤繁琐、耗时长、需要多种大型仪器，这极大的限制了在临床诊断等方面的应用。除此之外，大多数方法只能实现DNA损伤的半定量分析，而无法对DNA损伤位点的个数进行绝对定量，给污染物的毒性效应评价工作带来了巨大的挑战。因此，利用纸芯片作为检测平台并结合TdT可识别基因组任意位点暴露出的3’-OH末端特性可建立准确、快速的定量检测方法，对于临床诊断、食品安全、环境监测等方面至关重要。

发明内容

本发明为了解决现有的技术问题，利用多孔纤维素纸作为检测平台，提供了一种可绝对定量检测DNA损伤的方法。纤维素纸有限的孔道结构可抑制TdT在DNA的3’-OH末端重复添加脱氧核糖核苷酸。利用上述原理，在纸芯片上将具有特异性识别DNA 3’-OH末端的TdT与多孔的纤维素纸相结合，通过荧光法对基因组的损伤位点进行绝对定量检测，可扩大DNA检测的实用价值。

本发明为解决上述技术问题，提供了一种通过控制多孔纤维素纸孔径来实现对TdT聚合能力控制的方法。

一种利用纸芯片对基因组损伤位点数进行绝对定量的检测方法，包括如下步骤：

(1)通过喷蜡打印机制备纸芯片器件；

(2)将具有3’-OH断裂损伤类型的待检测基因组DNA加入到纸芯片器件的反应区进行孵育干燥；

(3)孵育完成后，向纸芯片器件的反应区加入反应液，孵育一段时间后，加入乙二胺四乙酸终止反应，用PBS洗涤后，拍照检测荧光强度，以实现基因组DNA损伤位点数定量检测；所述反应液为末端脱氧核苷酸转移酶与核酸标记荧光染料FITC-dUTP的混合溶液，其中核酸标记荧光染料FITC-dUTP与末端脱氧核苷酸转移酶物质量的比值大于500。