[发明专利]一种人食管鳞状细胞癌环状RNA标志物及其应用

权利要求书

1.一种人食管鳞状细胞癌环状RNA标志物，其特征在于：所述标志物包括4个环状RNA，分别为hsa_circ_0000005、hsa_circ_0007541、hsa_circ_0008199、hsa_circ_0077536，对应的基因核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。

2.如权利要求1所述的人食管鳞状细胞癌环状RNA标志物在用于预测人食管鳞状细胞患者临床预后的用途。

3.如权利要求1所述的人食管鳞状细胞癌环状RNA标志物在用于制备人食管鳞状细胞癌检测制剂中的用途。

4.如权利要求1所述的人食管鳞状细胞癌环状RNA标志物在用于制备人食管鳞状细胞癌患者预后预测试剂盒中的用途。

5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述试剂盒包含特异性针对标记hsa_circ_0000005、hsa_circ_0007541、hsa_circ_0008199和hsa_circ_0077536的引物或探针，以及标准品。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述引物的具体序列如下：

hsa_circ_0007541-上游引物：TTAGCCACCCTGAGTTTGAAGAAG；

hsa_circ_0007541-下游引物：GAGGTTGGTTATCCAGTCCAGAAG；

hsa_circ_0000005-上游引物：CGCATGGAGATCACAATAAGGA；

hsa_circ_0000005-下游引物：CCTTCTGCTGAATGGCTATGAT；

hsa_circ_0008199-上游引物：AGTAATTGTGGTTGCGTGAGAG；

hsa_circ_0008199-下游引物：AAGATAGTCCTGGGTGCTGTTT；

hsa_circ_0077536-上游引物：ACCTTCTGCACTGTCCATCTAA；

hsa_circ_0077536-下游引物：TGTCTTCTTGTCTCATAACCTTCTG。

7.一种采用权利要求6所述的人食管鳞状细胞癌环状RNA标志物的检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：样品总RNA的提取、样品cDNA的制备和环状RNA的扩增，具体方法如下：

(1)样品总RNA的提取：按照TRIzol试剂说明书步骤提取食管鳞状细胞癌肿瘤组织总RNA，检测提取RNA的浓度和纯度，并通过琼脂糖凝胶电泳质检确定提取RNA的完整性；

(2)样品cDNA的制备：采用TIANScriptⅡRT Kit试剂盒试剂及相应步骤对提取的总RNA反转录，合成cDNA；

(3)环状RNA的扩增：采用TBPremix Ex Taq^TM荧光定量PCR试剂盒试剂及相应步骤，以反转录的cDNA为模板，通过StepOnePlus^TMReal-Time PCR系统，分别对4种环状RNA进行PCR扩增。

8.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述单个环状RNA的PCR扩增体系为：10μmol/L的上游引物0.8μL,10μmol/L的下游引物0.8μL，ESCC样本cDNA 2μL，50×ROXReference Dye 0.4μL，TB Green Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(2×)10μL，去离子水6μL。

9.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增程序为：95℃30s预变性；接40个循环：95℃5s，60℃30s；

PCR溶解曲线的生成反应程序为：95℃15s，60℃60s，95℃15s。