[发明专利]一种用于制备奥利司他中间体的生物酶及其应用

说明书

本发明属于生物制药技术领域，具体公开了一种用于制备奥利司他中间体的生物酶及其应用。本发明提供的生物酶为短链醇脱氢酶，作用于底物β‑羟基十四烷酸酯，以合成高手性ee值(ee＞99％)的奥利司他中间体(R)‑β‑羟基十四烷酸酯，本发明通过对生物酶进行基因工程改造，提高了生物酶的催化效率和稳定性，进而提高底物的转化率和产物产率，降低生产成本，提高酶催化合成奥利司他中间体的经济实用性，本发明的生物酶更适合应用于奥利司他中间体的工业化生产。

技术领域

本发明涉及生物制药技术领域，特别是涉及一种用于制备奥利司他中间体的生物酶及其应用。

背景技术

奥利司他(Orlistat)是第一个上市的非中枢神经作用的减肥药物，也是一种非处方减肥药物。奥利司他直接作用于胃肠道内胃脂肪酶和胰脂肪酶活性部位，使之失活而不能将食物中的脂肪水解，从而抑制人体对脂肪尤其是甘油三酯的吸收，减少热量摄取。奥利司他靶点特异性好，抑制脂肪吸收效果显著，经口服给药，肠道不易吸收，对身体副作用小、安全性好，已被市场广为接受。随着超重乃至肥胖人口增多，奥利司他的市场需求越来越大，因此，有必要进一步提高奥利司他及其中间物的合成效率，降低生产过程中的环境污染。

(R)-β-羟基十四烷酸酯是合成药物奥利司他的重要中间体，该中间体的光学纯度对于奥利司他的制备极为关键。因此，开发一种能高效制备光学纯(R)-β-羟基十四烷酸酯的方法具有重要的应用前景。

中国发明专利CN109022473A提供了一种酶法制备奥利司他中间体(R)-β-羟基十四烷酸酯的方法，该发明利用短链醇脱氢酶催化法制备高手性ee值(ee＞99％)的奥利司他中间体(R)-3-羟基-十四烷酸甲酯，能减少生产成本及对环境的污染。

其中，(R)-β-羟基十四烷酸酯生物催化反应路线为：

R＝CH₃或C₂H₅。

中国发明专利CN111154736A也公开了一种用于制备奥利司他中间体(R)-β-羟基十四烷酸酯的方法，该方法为生物酶法，其生物酶为酮还原酶JR3789，来源于Singulisphaera acidiphila，NCBI数据库中的编码为WP_015245403.1，属于短链脱氢酶家族，大小为249个氨基酸。

对于奥利司他中间体的制备，上述发明提供的生物酶催化方法均体现出条件温和、环境友好、产物纯度高等优势。这表明生物酶(短链醇脱氢酶)催化对于(R)-β-羟基十四烷酸酯的制备具有重要意义。因此，在上述现有技术的基础上，本发明旨在开发一种以β-羰基十四烷酸酯为底物、且催化活性和稳定性更好的新的生物酶(短链醇脱氢酶)，进一步提高底物的转化率和产物产率，降低生产成本。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种用于制备奥利司他中间体的生物酶及其应用，本发明提供的生物酶为系列短链醇脱氢酶，作用于底物β-羟基十四烷酸酯，以合成高手性ee值(ee＞99％)的奥利司他中间体(R)-β-羟基十四烷酸酯，本发明通过对生物酶进行基因工程改造，提高了所述生物酶的催化效率和稳定性，进一步提高底物的转化率和产物产率，降低生产成本，提高酶催化合成奥利司他中间体的经济实用性。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种用于制备奥利司他中间体的生物酶，所述奥利司他中间体为(R)-β-羟基十四烷酸酯，其结构式如I所示，所述生物酶作用的底物为β-羰基十四烷酸酯，其结构式如II所示；所述生物酶为短链醇脱氢酶，所述短链醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1和/或与SEQ ID NO.1同源性大于90％的序列所示；和/或，所述短链醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2和/或与SEQ ID NO.2同源性大于90％的序列所示；和/或，所述短链醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3和/或与SEQID NO.3同源性大于90％的序列所示；