[发明专利]一种沙门氏菌闭管快速可视化检测试剂盒及其检测方法

说明书

本发明提供一种沙门氏菌闭管快速可视化检测试剂盒及其检测方法。该沙门氏菌快速检测试剂盒包含如下组分：集成管、纳米金增强的LAMP扩增体系、以及负染检测的相关试剂。本发明将纳米金增强的LAMP恒温扩增和负染可视化技术结合起来，实现了对沙门氏菌的闭管检测，具有三重防污染、快速、特异性强、高灵敏、可视化等特点。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及一种沙门氏菌闭管快速可视化检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

沙门氏菌是革兰氏阴性、兼性厌氧型微生物，最适生长温度是37℃，在20℃以上即可大量繁殖，且在低温条件下可以存活3~4个月。它是最常见的食源性致病菌，常存在于人畜肠道内，为人畜共患病原体。据统计，我国内陆地区在细菌性食物中毒中沙门氏菌位于首位。目前沙门氏菌检测的金标准为生化特性检测，即发酵葡萄糖、麦芽糖、甘露醇和山梨醇产气；不发酵乳糖、蔗糖；不产生吲哚、V-P反应阴性；不水解尿素和对苯丙氨酸不脱氨。但是该方法耗时耗力，对于沙门氏菌的现场快速检测需求难于满足。近年来，随着分子生物学的迅猛发展，鉴定沙门氏菌的方法扩展到免疫学方法和分子生物学方法。最为常见的分子生物学方法中以PCR和LAMP扩增为主，针对沙门氏菌的特异性基因组进行引物设计，实现沙门氏菌的快速检测。随着科学水平的不断发展，人们的生活水平不断提高，因此针对于食品病原菌的快速检测也提出了更高的要求，即能够实现现场、快速、高灵敏、强特异、低成本等特点。

其中LAMP扩增是一种成熟的等温扩增技术，该技术利用内引物、外引物与聚合酶结合，在恒温条件下进行等温扩增反应，非常适合于目前对于沙门氏菌检测的要求。但是该方法的扩增效率与易污染一直都是该技术方法开发的难题。由于LAMP引物设计的特殊性，该反应自身就具有高扩增效率，但是靶标不存在时也能扩增出假阳性的现象，即扩增效率与假阳性现象紧密相关。目前针对于纳米材料对于核酸扩增技术的影响研究越来越多，但是还没有相关文献报道纳米材料对于LAMP扩增效率的影响。且LAMP易污染问题除了注意操作环境、引物设计外没有更好的解决办法。

基于此，本申请提供一种沙门氏菌闭管快速可视化检测试剂盒及其检测方法。闭管检测实现了沙门氏菌的三重防污染检测，即通过集成管的螺口密封，石蜡油液封以及CuSO₄实现；提升LAMP扩增效率通过增加纳米金实现；可视化通过CuSO₄与阴性样品混合负染生成环形聚集物实现。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种沙门氏菌闭管快速可视化检测试剂盒及其检测方法。本发明将纳米金增强的LAMP恒温扩增和CuSO₄负染可视化结合起来，实现了对沙门氏菌的闭管检测，具有三重防污染、快速、特异性强、高灵敏、可视化等特点。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种沙门氏菌检测试剂盒，包括如下组分：集成管、纳米金增强的LAMP扩增体系以及负染检测相关试剂；

集成管为自制螺口管，有管身和管盖组成；负染检测相关试剂提前风干于集成管管盖内侧。

纳米金增强的LAMP扩增体系包括如下组分：LAMP扩增引物、dNTPs、甜菜碱、MgSO₄、缓冲液、Bst DNA聚合酶、纳米金、石蜡油及水；

其中LAMP扩增引物包括：

inv A-F3引物：序列如SEQ ID NO：1；

inv A-B3引物：序列如SEQ ID NO：2；

FIP引物：序列如SEQ ID NO：3；

BIP引物：序列如SEQ ID NO：4；

负染检测相关试剂为0.1M CuSO₄溶液，提前取5μL CuSO₄溶滴加在集成管管盖上风干。