[发明专利]一种RAP基因检测试剂盒、检测方法和应用及RAP病毒检测试剂盒

说明书

本发明涉及一种RAP基因检测试剂盒、检测方法和应用及RAP病毒检测试剂盒，属于基因扩增技术领域。本发明所述试剂盒包括外引物对、内引物对、探针和反应液，所述外引物对基于重组酶介导的等温扩增方法设计得到，所述内引物对和探针基于实时荧光定量核酸扩增方法设计得到；所述反应液包括重组酶介导的等温扩增反应液和实时荧光定量核酸扩增反应液。本发明所述试剂盒具有高检测特异性以及超高的灵敏性，检测高效且快速。

技术领域

本发明涉及基因扩增技术领域，具体涉及一种RAP基因检测试剂盒、检测方法和应用及RAP病毒检测试剂盒。

背景技术

重组酶介导的等温扩增(recombinase aided amplification，RAA)是一种新型的在37～39℃恒温扩增的分子诊断技术。RAA具有很高的扩增效率，30min甚至更短时间即可实现对目的片段的大量的扩增。但是RAA技术需要很长的探针(长度需要45～50bp)，导致设计探针难度较大。聚合酶链式反应(PCR)是一种目前被广泛用于诊断的核酸分子诊断技术，PCR衍生技术定量PCR(qPCR)是目前很多病原体核酸检测的金标准，但是灵敏度有待提高。巢式PCR(N-PCR)可以提高PCR检测灵敏度，但是N-PCR具有容易污染，耗费时间长等缺点。目前仍缺乏一种更高效的基因扩增方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种RAP基因检测试剂盒、检测方法和应用及RAP病毒检测试剂盒。本发明所述试剂盒具有高检测特异性以及超高的灵敏性，检测高效且快速。

本发明提供了一种RAP基因检测试剂盒，所述试剂盒包括外引物对、内引物对、探针和反应液，所述外引物对基于重组酶介导的等温扩增方法设计得到，所述内引物对和探针基于实时荧光定量核酸扩增方法设计得到；

所述反应液包括重组酶介导的等温扩增反应液和实时荧光定量核酸扩增反应液。

优选的是，所述外引物对中，引物的长度分别为30～35bp。

优选的是，所述反应液包括独立包装的镁离子。

本发明还提供了基于上述技术方案所述试剂盒的RAP基因检测方法，包括以下步骤：

利用上述技术方案所述试剂盒对待测模板进行检测，先进行重组酶介导的等温扩增反应，再进行实时荧光定量核酸扩增反应。

优选的是，所述RAP基因检测方法，包括以下步骤：

将外引物对、待测模板、重组酶介导的等温扩增反应液、镁离子和水混合，置于PCR管的管盖上；

将内引物对、探针、实时荧光定量核酸扩增反应液和水混合，置于PCR管的管底；

盖上管盖，采用重组酶介导的等温扩增反应条件进行扩增，离心，采用实时荧光定量核酸扩增反应条件进行扩增。

优选的是，所述重组酶介导的等温扩增反应条件包括39℃恒温反应10min。

优选的是，所述实时荧光定量核酸扩增反应条件包括：95℃，10min；95℃，15s，60℃，30s，72℃，30s，20个循环。

本发明还提供了上述技术方案所述试剂盒或上述技术方案所述检测方法在检测靶基因中的应用。

本发明还提供了基于上述技术方案所述试剂盒或上述技术方案所述检测方法的RAP病毒检测试剂盒，所述病毒包括腺病毒3型、腺病毒7型和呼吸道合胞病毒。

优选的是，当所述病毒为腺病毒3时，所述外引物对的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示，所述内引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；