[发明专利]诱导多能干细胞分化培养心脏成纤维细胞的方法及其培养液

权利要求书

1.一种诱导多能干细胞分化培养心脏成纤维细胞的方法，其特征在于包括如下步骤：

步骤S1，用促心脏中胚层祖细胞培养液对诱导多能干细胞进行定向分化培养得到心脏中胚层祖细胞；具体为，于35～39℃、3～7％CO₂条件下，用促心脏中胚层祖细胞培养液对诱导多能干细胞进行定向分化培养1～3天，移除未贴壁的细胞，定向分化得到心脏中胚层祖细胞；

所述促心脏中胚层祖细胞培养液的成分包括：RPMI 1640基础培养基，人血清白蛋白，L-抗坏血酸2磷酸，聚乙烯醇，Wnt激活剂，BMP拮抗剂和FGF激活剂；所述人血清白蛋白浓度为1～5mg/mL，所述L-抗坏血酸2磷酸浓度为50～100μg/mL；所述聚乙烯醇质量浓度为0.1％～10％；所述Wnt激活剂浓度为4～8μmol/L；所述BMP拮抗剂浓度为1～10ng/mL；所述FGF激活剂浓度为1～10ng/mL；

步骤S2，心脏中胚层祖细胞用促第二心场祖细胞培养液继续分化培养得到第二心场祖细胞；具体为，心脏中胚层祖细胞于35～39℃、3～7％CO₂条件下用促第二心场祖细胞培养液继续培养3～5天得到第二心场祖细胞，继续培养期间每1-2天更换一次培养液；所述促第二心场祖细胞培养液包括心脏成纤维培养液、β-巯基乙醇和FGF激活剂；所述β-巯基乙醇在所述心脏成纤维培养液中的浓度为0.1～10mmol/L；所述FGF激活剂在所述心脏成纤维培养液中的浓度为25～100ng/mL；

步骤S3，第二心场祖细胞经消化后再用心脏成纤维细胞培养液培养得到纯化的成熟心脏成纤维细胞；具体为，步骤S2得到的促第二心场祖细胞用TryplE消化，按3000-5000cells/cm²密度接种，于35-39℃、3-7％CO₂条件下，用心脏成纤维细胞培养液培养5～7天得到纯化的成熟心脏成纤维细胞，并进行传代培养5～10次；所述心脏成纤维细胞培养液包括：DMEM高糖培养基DMEM high glucose with GlutaMAX supplement，KnockOut^TM SRXenoFree CTS^TM和MEM Non-Essential Amino Acids Solution；所述KnockOut^TM SRXenoFree CTS^TM浓度为5％-15％；所述MEM Non-Essential Amino Acids Solution浓度为0.5％-2％。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：

步骤S1，具体为，于37℃、5％CO₂条件下，用促心脏中胚层祖细胞培养液对诱导多能干细胞进行定向分化培养2天，移除未贴壁的细胞，定向分化得到心脏中胚层祖细胞；

步骤S2，具体为，心脏中胚层祖细胞于37℃、5％CO₂条件下用促第二心场祖细胞培养液继续培养4天得到第二心场祖细胞，继续培养期间每2天更换一次培养液；

步骤S3，具体为，步骤S2得到的促第二心场祖细胞用TryplE消化，按3000-5000cells/cm²密度接种，于37℃、5％CO₂条件下，用心脏成纤维细胞培养液培养5～7天得到纯化的成熟心脏成纤维细胞，并进行传代培养5～10次。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述诱导多能干细胞用外周血单核细胞电转质粒法获得。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Wnt激活剂为CHIR99021，所述BMP拮抗剂为BMP4，所述FGF激活剂为FGF2。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述人血清白蛋白浓度为2.5mg/mL，所述L-抗坏血酸2磷酸浓度为75μg/mL；所述聚乙烯醇质量浓度为2.5％；所述Wnt激活剂浓度为6μmol/L；所述BMP拮抗剂浓度为5ng/mL；所述FGF激活剂浓度为5ng/mL。