[发明专利]诱导多能干细胞分化培养心脏成纤维细胞的方法及其培养液

说明书

本发明公开了一种诱导多能干细胞分化培养心脏成纤维细胞的方法及其培养液，所述方法包括：用促心脏中胚层祖细胞培养液对诱导多能干细胞进行定向分化培养得到心脏中胚层祖细胞；再用促第二心场祖细胞培养液继续分化培养得到第二心场祖细胞；最后再用心脏成纤维细胞培养液培养得到纯化的成熟心脏成纤维细胞。本发明所述的培养方法中，取材方便，培养时间短，分化效率高，且获得的心脏成纤维细胞可用于临床治疗心力衰竭，以及体外疾病建模研究、药物筛选和其他生物医学应用。

技术领域

本发明属于干细胞治疗技术领域的干细胞分化技术，具体涉及一种诱导多能干细胞分化培养心脏成纤维细胞的方法及其培养液。

背景技术

心脏成纤维细胞具有两个重要功能：细胞外基质的产生、重塑，以及能够分泌细胞外小泡中生长因子和调节分子的复杂混合物，具有调节心脏功能的作用。当心脏受损时，心脏成纤维细胞可被激活用来修复受损的心肌细胞。为恢复受损的心脏功能，移植心脏成纤维细胞是必要的，而心肌成纤维又是不同于体内其他成纤维细胞的组织特异性细胞，有限数量的可用供体是临床移植的一个明显且关键的限制。其中一个具有巨大临床应用潜力的方法是用诱导多能干细胞在体外分化为心脏成纤维细胞，并进一步用于人体心脏受损的移植治疗。此项技术不需要使用卵细胞或胚胎细胞，避开了胚胎干细胞研究应用带来的伦理道德问题；同时，该方法产生的心脏成纤维细胞能够在培养过程中大量地增殖，可以为病人提供同基因型心脏成纤维细胞的无限来源。病人自体细胞重编程来源的诱导多能干细胞经诱导分化获得的心脏成纤维细胞应用于个体治疗能有效地避免免疫排斥反应，可最大程度提高临床治疗效果。

心脏发育机制研究显示心外膜在发育早期支持心肌细胞增殖，并向发育中的心脏提供成纤维细胞和血管平滑肌细胞。现有的由多能干细胞分化为心脏成纤维细胞的方法主要集中于从人类多能干细胞中诱导分化产生心外膜细胞，随后分化为心脏成纤维细胞。如最新的一项专利(CN105518125A)采用人多能干细胞在BMP4、bFGF和活化素A作用下处理3～5天获得KDR+和PDFGα+心血管中胚层祖细胞群体，KDR+和PDFGα+心血管中胚层祖细胞群体与WNT抑制剂和BMP4渗透接触产生WT1+心血管祖细胞群体，再用包含VEGF成分的成熟混合液持续培养数天，产生表达WT1和EPDC的心外膜谱系细胞。该方法培养周期长，且获得的心脏成纤维细胞纯度较低，含有大量非成纤维细胞群体，如心血管平滑肌谱系细胞群体和表达视黄醇脱氢酶的心外膜谱系细胞群体等。另一专利(CN108148802A)则是通过激活WNT信号通路将多能干细胞诱导分化成中胚层细胞，再通过抑制WNT信号通路中胚层细胞转化成心肌前体细胞，然后通过激活成纤维细胞生长因子信号通路和WNT信号通路使获得的心肌前体细胞转化成TBX18和WT1双阳性的前心外膜细胞，再用前心外膜细胞制备心外膜细胞，用bFGF处理心外膜细胞，之后再用bFGF加胎牛血清处理得到心脏成纤维细胞。此分化系统程序相当繁琐，且所用试剂复杂，含有动物源成份，对后期的临床治疗应用不利。因此，虽然有诱导多能干细胞向心外源细胞分化，进一步产生心脏成纤维细胞的方法，但获得特征良好的心脏成纤维细胞的有效分化方法尚未被描述。

综上所述，急需开发一种有效的由多能干细胞产生心脏成纤维细胞的培养液和方法，使体外获得的心脏成纤维细胞在疾病机制研究、药物筛选及临床细胞治疗中得到有效应用。

发明内容

本发明以诱导多能干细胞为原材料，采用WNT、BMP和FGF信号顺序调制来产生心脏中胚层祖细胞，进一步分化为第二心场祖细胞，最终有效地生成心脏成纤维细胞。本发明提供了一种由诱导多能干细胞培养心脏成纤维细胞，可大大缩短心脏成纤维细胞制备周期的方法，培养液成分明确且不含动物源成分，获得的心脏成纤维细胞可应用于临床治疗。

本发明的诱导多能干细胞分化培养心脏成纤维细胞的方法包括如下步骤：

步骤S1，用促心脏中胚层祖细胞培养液对诱导多能干细胞进行定向分化培养得到心脏中胚层祖细胞；

步骤S2，心脏中胚层祖细胞用促第二心场祖细胞培养液继续分化培养得到第二心场祖细胞；