[发明专利]一种人内胚层分化培养基以及培养方法

说明书

本发明提供了一种人内胚层诱导分化培养基，所述培养基由以下培养基A和培养基B组成：培养基A由以下组分组成：DMEM/F12培养基、维生素C和ChIR99021；培养基B由以下组分组成：DMEM/F12培养基、维生素C和LDN‑193189。同时还提供了一种体外诱导干细胞向内胚层细胞分化的方法，使用本发明的诱导分化获得的内胚层可在体外分化为肝细胞，胰腺前体细胞和肺前体细胞，在体内畸胎瘤实验中亦发现可向肺，胃肠道上皮细胞分化，表明此方法分化而来的内胚层具有分为肝，肺和胰腺的潜力。

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种人内胚层分化培养基以及培养方法。

背景技术

根据胚胎的早期发育机制，目前已有很多种将hPSCs分化为内胚层的方法。但目前还没有无异原性，全合成，低成本的方法出现。2005年Emmanuel E Baetge研究组使用含有2％FBS的RPMI-1640作为基础培养基，通过加入Activin A和Wnt3A诱导内胚层分化，分化效率可达80％，但使用了血清和细胞因子，含有外源性成分血清，成本高(D'Amour et al.,2005)。2009年Douglas A.Melton研究组通过筛选4000多种小分子化合物发现IDE1和IDE2可以取代Activin A诱导内胚层分化，但是后续没有课题组可以重复出来，同时这种方法使用FBS含有外源性成分(Bogacheva et al.,2018；Borowiak et al.,2009)。2014年RohitN.Kulkarni研究组使用通过在不含血清的基础培养基中加入Wnt3A和BMP4成功将hPSCs分化为内胚层，但仍然使用了细胞因子，成本较高(Teo et al.,2014)。2015年Shoen Kume研究组通过加入DMSO将Activin A的浓度从100ng/ml降至6.25ng/ml，分化的内胚层可分化为肠上皮细胞。降低了诱导成本，但是分化的基础培养基中含有B27，B27中含有异源性成分BSA(Ogaki et al.,2015)。2017年Heiko Lickert研究组通过筛选23406种小分子化合物，发现84种化合物可促进内胚层分化，从中选取了Fasudil和RKI-1447进行验证，发现它们诱导内胚层的效率在50％以上。虽然不使用细胞因子，但是基础培养基中使用0.5％BSA，有异源性成分，而且分化效率比较低(Korostylev et al.,2017)。2019年Falk F.R.Buettner研究组通过三维培养建立了成分明确，无异原性B27诱导内胚层分化，但要使用50ng/mlActivin A，成本仍然很高(Diekmann et al.,2019)。2019年Danwei Huangfu研究组通过CRISPR-Cas9全基因组筛选发现JNK通路抑制内胚层分化，使用JNK通路抑制剂JNK-IN-8可使Activin A使用浓度从100nM/ml降至10ng/ml，减少了成本，但使用了BSA，含有外源性成分(Li et al.,2019)。

因此，目前还能完全做到兼顾全合成、高效率、低成本、无异源性物质的有效方法用于体外人多能干细胞向内胚层诱导。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种无异源性，无血清，无生长因子，小分子人内胚层分化培养基，通过该培养基诱导人多能干细胞定向分化为内胚层细胞，并能进一步形成肝细胞，肺前体细胞，胰腺前体细胞。

本发明通过以下技术方案实现：

一种人内胚层诱导分化培养基，由以下培养基A和培养基B组成：培养基A由以下组分组成：DMEM/F12培养基、维生素C和ChIR99021；培养基B由以下组分组成：DMEM/F12培养基、维生素C和LDN-193189。

优选地，所述维生素C的浓度为50～100mg/ml。更优选地，所述维生素C的浓度为71mg/ml。

优选地，所述ChIR99021的浓度为1～6μM。更优选地，所述ChIR99021的浓度为3μM。