[发明专利]一种引物设计灵活的多功能DNA恒温扩增方法及其应用

说明书

本发明涉及一种引物设计灵活的多功能DNA恒温扩增方法及其应用，其采用第一和第二引物对、识别并切除双链DNA中一条链内的非常规DNA碱基的酶和具有链置换功能的DNA聚合酶的混合物；第一引物对中的每一条引物各自包含被编码区隔开的非常规碱基修饰区和与待扩增DNA的上游端或下游端互补的识别区，在非常规碱基修饰区中至少与编码区相邻位点处的常规DNA碱基被替换成非常规DNA碱基；第二引物对中的每一条引物各自包含与第一引物对中的每一条引物中的非常规碱基修饰区相同的非常规碱基修饰区；在恒定温度和两种酶的作用下，第一和第二引物对以模板进行扩增。其引物设计简单，实现DNA灵敏高效的扩增和更多功能。

技术领域

本发明属于分子生物学和生物检测领域，尤其涉及一种引物设计灵活的多功能DNA恒温扩增方法及其在DNA检测中的应用。

背景技术

核酸体外扩增是分子生物学研究的基础，随着生物技术的发展，出现了越来越多的核酸体外扩增技术，如聚合酶链式反应、环介导的等温扩增、滚环扩增、依赖解旋酶的DNA等温扩增等。核酸体外扩增是核酸分析中的一个重要环节，是方法灵敏度、特异性等重要技术参数指标的保证。

聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）是根据靶基因序列设计1对特异的引物，在体外模拟DNA的天然复制的过程，其特异性依赖于针对靶序列的引物，由变性-退火-延伸三个基本反应步骤组成，在2-3小时内即实现对靶基因几百万倍的扩增放大。该技术依赖于特殊精密的热循环设备，反应所需的时间较长，导致检测总成本高，不适用于样品的快速检测。

滚环扩增（rolling circle amplification，RCA）依赖于环状模板，但绝大多数基因组DNA为线性分子，且合成滚环扩增锁式探针的成本高，存在信号背景问题。依赖解旋酶的DNA等温扩增（helicase-dependent amplification，HDA）则受到DNA解旋酶的限制，主要用于扩增小片段的DNA序列。

环介导的等温扩增反应（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一种在等温条件下进行核酸扩增的技术，可以广泛应用于食品安全检测等领域。该技术灵敏度高，在等温条件下扩增15分钟至1小时即可产生10⁹～10¹⁰倍的扩增子，但若实验环境被气溶胶污染，则很容易产生假阳性结果。另外，由于扩增反应过程中涉及到多条引物，引物间很容易发生非特异性结合，产生引物二聚体，从而消耗反应体系中的反应底物，降低反应效率和检测灵敏度，同时又容易导致结果假阳性，使得结果误判。并且，现有的等温扩增方法在设计引物时完全依赖于靶标序列，因此易受到靶标序列的限制，可能存在因无法设计引物而不能扩增特定序列的问题。因此，如何优化等温扩增反应，使得其既有较高检测灵敏度、又抑制非特异性扩增，同时在引物设计方面更加灵活，一直是该技术领域急需解决的技术难题。并且，目前的核酸检测方法还对实现更多的功能的检测，如产物的捕获、富集、标记、多重检测等等有更强烈的需求。一旦攻克这个难题，则可以扩大核酸分析技术在分子生物学与疾病诊断等相关领域的应用。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种简单、高效、特异性好、灵敏度高，且可以实现更多功能的DNA恒温扩增方法。

本文所述的常规DNA碱基是指腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、鸟嘌呤（G）和胞嘧啶（C），本文所述的非常规DNA碱基是指除腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、鸟嘌呤（G）和胞嘧啶（C）之外的DNA碱基。

本发明所述的DNA恒温扩增方法包括：