[发明专利]一种引物设计灵活的多功能DNA恒温扩增方法及其应用

权利要求书

1.一种DNA恒温扩增方法，所述方法包括：

（1）制备反应混合物，其中所述反应混合物包含待扩增的DNA、第一引物对、第二引物对、三磷酸脱氧腺苷、三磷酸脱氧鸟苷、三磷酸脱氧胞苷、三磷酸脱氧胸苷、识别并切除双链DNA中的一条链内的非常规DNA碱基的酶和具有链置换功能的DNA聚合酶；其中所述第一引物对中的每一条引物各自包含被编码区隔开的非常规碱基修饰区和与待扩增的DNA的上游端或下游端互补的识别区，其中在所述非常规碱基修饰区中至少与编码区相邻位点处的常规DNA碱基被替换成非常规DNA碱基；所述第二引物对中的每一条引物各自包含与所述第一引物对中的每一条引物中的非常规碱基修饰区相同的非常规碱基修饰区；其中所述非常规碱基的数量为2-15个；

（2）将步骤（1）获得的反应混合物置于恒定温度下，在识别并切除双链DNA中的一条链内的非常规DNA碱基的酶和具有链置换功能DNA聚合酶的作用下，第一引物对和第二引物对以待扩增的DNA为模板进行DNA扩增。

2.根据权利要求1所述的DNA恒温扩增方法，其中所述非常规DNA碱基选自：5-羧基胞嘧啶、乙烯基胞嘧啶、乙烯基腺嘌呤、3-甲基腺嘌呤、7-甲基腺嘌呤、3-甲基鸟嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、N6-甲基腺嘌呤、次黄嘌呤、脱氧次黄嘌呤、8-氧鸟嘌呤，及其任意组合。

3.根据权利要求1或2所述的DNA恒温扩增方法，其中所述识别并切除双链DNA中的一条链内的非常规DNA碱基酶选自DNA糖基化酶和/或核酸内切酶V。

4.根据权利要求3所述的DNA恒温扩增方法，其中所述DNA糖基化酶选自：胸腺嘧啶DNA糖基化酶、甲基嘌呤DNA糖基化酶、8-羟基鸟嘌呤糖基化酶1、8-氧鸟嘌呤DNA糖基化酶，及其任意组合。

5.根据权利要求1所述的DNA恒温扩增方法，其中所述具有链置换功能的DNA聚合酶选自：Phi29 DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、PyroPhage 3137 DNA聚合酶、Vent聚合酶、9°Nm聚合酶、Klenow DNA聚合酶、缺少3’-5’外切酶活性的T7 phase DNA聚合酶变种、超保真DNA聚合酶、Taq聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶、LongAmpTaq DNA聚合酶、OneTaq DNA聚合酶、TopoTaqDNA聚合酶，及其任意组合。

6.根据权利要求5所述的DNA恒温扩增方法，其中所述Vent聚合酶是Deep Vent聚合酶、Vent（-exo）聚合酶或Deep Vent（-exo）聚合酶。

7.根据权利要求1所述的DNA恒温扩增方法，其中所述非常规碱基修饰区和识别区的长度分别为12-30个碱基。

8.根据权利要求7所述的DNA恒温扩增方法，其中所述非常规碱基均匀地分布在所述非常规碱基修饰区中。

9.根据权利要求1所述的DNA恒温扩增方法，其中所述反应混合物进一步包含pH值调节剂，使得所述反应混合物的pH值维持在7.5-9.5之间。

10.根据权利要求9所述的DNA恒温扩增方法，其中所述反应混合物进一步包含一种或多种选自下组的成分：Mg²⁺、K⁺、NH₄⁺、H⁺、Cl^-、SO₄^2-、Tris-HCl和细胞表面活性剂。

11.根据权利要求10所述的DNA恒温扩增方法，其中所述细胞表面活性剂为Triton X-100。