[发明专利]一种靶标基因富集建库方法

说明书

一种靶标基因富集建库方法，包括：磷酸化步骤，包括在模板分子的5’端修饰磷酸基团；延伸步骤，包括加入第一引物，第一引物的5’端修饰有标记分子，在模板分子的靶标区域退火并延伸，获得双链靶核苷酸，双链靶核苷酸含有由5’端修饰有标记分子的第一引物延伸得到的延伸链；第一测序接头连接步骤，包括将第一测序接头连接至双链靶核苷酸序列；解链步骤，包括将前一步骤所得产物解链处理，去除5’端修饰有标记分子的第一引物延伸链，得到连接有第一测序接头的模板分子，即为单链靶核苷酸分子；第二测序接头连接步骤；扩增步骤，包括加入第二引物、第三引物，PCR反应，得到完整文库。将建库和靶标基因富集整合为一体，显著缩短流程。

技术领域

本发明涉及基因测序技术领域，具体涉及一种靶标基因富集建库方法。

背景技术

高通量测序靶标基因测序文库的制备流程一般分为两套流程，主流的捕获建库方法需要经历文库构建(包括新型建库方法单链建库)、捕获前扩增、杂交捕获、捕获后扩增四个必需步骤，全流程一般长达2到3天。另一种常见方法称为扩增子建库，一般先做多重PCR，后对PCR产物建库，有的商业化试剂盒会在做多重PCR时，在引物的5′端外侧加上对应NGS平台的接头序列，以将上述两步整合为一步(即一步法多重PCR试剂盒)。

第一种主流技术路线必须将文库构建和杂交捕获严格分开，步骤繁多周期长，各模块之间衔接有一定技术难度，且杂交捕获所需试剂和捕获专用探针合成严重依赖进口。第二种技术路线虽然流程较前者更简洁，但因其基于多重PCR，有如下诸多问题：1、因其基于PCR扩增，使文库中存在大量扩增所得同样的拷贝分子，导致测序所得结果的冗余率高，浪费测序数据量，且使有效数据率降低，导致超低频的基因突变难以检出或无法准确检出；2、由于PCR引物之间互相干扰，同一反应体系里PCR重数(即多少个单一PCR混合在多重PCR反应)无法过多(一般不超过1000重)，导致较大panel的基因检测很难通过单管反应完成，只能分成多个单管反应，然后合并产物来实现，大大增加了成本，延长了操作时间，不利于推广；3、PCR需要两端引物配对，导致其无法检测未知的融合基因(novel fusion)和病毒插入位点等基因组结构性变异；4、PCR的指数性扩增使不同基因间的拷贝数没有得到等比例的线性放大，导致其无法检测基因拷贝数变异；5、多重PCR不可避免的扩增偏好性导致均一度低，导致panel中部分区域不能很好覆盖(这些区域的突变无法准确检出)，而部分区域过多覆盖(造成局部测序数据量浪费)。

发明内容

本发明提供一种靶向富集建库方法

根据第一方面，一种实施例中提供一种靶标基因富集建库方法，包括：

磷酸化步骤，包括在模板分子的5’端修饰磷酸基团；

延伸步骤，包括加入含与靶标基因互补配对序列的第一引物，所述第一引物的5’端修饰有标记分子，在模板分子的靶标区域退火并延伸，获得双链靶核苷酸分子，所述双链靶核苷酸含有由5’端修饰有标记分子的第一引物延伸得到的延伸链；

第一测序接头连接步骤，包括将第一测序接头连接至前一步骤延伸处理后的双链靶核苷酸分子；

解链步骤，包括将前一步骤所得产物解链处理，去除5’端修饰有标记分子的第一引物延伸链，得到连接有第一测序接头的原始模板分子，即为单链靶核苷酸分子；

第二测序接头连接步骤，包括加入发夹式第二测序接头，使单链靶核苷酸分子连接所述发夹式第二测序接头；

扩增步骤，包括加入含与第一测序接头反向链互补配对序列的第二引物、含与第二测序接头反向链互补配对序列的第三引物，PCR反应，得到完整文库。

依据上述实施例的靶标基因富集及建库方法，将建库和靶标基因富集两步整合为一个流程，显著缩短实验所需时间。

附图说明

图1显示为一种实施例的流程图。

具体实施方式