[发明专利]一种靶标基因富集建库方法

权利要求书

1.一种靶标基因富集建库方法，其特征在于，包括：

磷酸化步骤，包括在模板分子的5’端修饰磷酸基团；

延伸步骤，包括加入含与靶标基因互补配对序列的第一引物，所述第一引物的5’端修饰有标记分子，在模板分子的靶标区域退火并延伸，获得双链靶核苷酸分子，所述双链靶核苷酸含有由5’端修饰有标记分子的第一引物延伸得到的延伸链；

第一测序接头连接步骤，包括将第一测序接头连接至前一步骤延伸处理后的双链靶核苷酸分子；

解链步骤，包括将前一步骤所得产物解链处理，去除5’端修饰有标记分子的第一引物延伸链，得到连接有第一测序接头的原始模板分子，即为单链靶核苷酸分子；

第二测序接头连接步骤，包括加入发夹式第二测序接头，使单链靶核苷酸分子连接所述发夹式第二测序接头；

扩增步骤，包括加入含与第一测序接头反向链互补配对序列的第二引物、含与第二测序接头反向链互补配对序列的第三引物，PCR反应，得到完整文库。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，磷酸化步骤中，所述模板分子为单链核苷酸分子和/或由双链核苷酸分子解链处理得到的单链核苷酸分子；

和/或，所述模板分子为亚硫酸氢盐转化处理后的DNA分子；

和/或，所述模板分子为单链DNA分子或由RNA转录得到的单链DNA分子。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，磷酸化步骤中，使用的酶选自T4多聚核苷酸激酶。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，延伸步骤中，所述第一引物的5’端修饰的标记分子选自生物素；

和/或，延伸步骤中，在DNA聚合酶作用下，第一引物在模板分子的靶标区域退火并延伸。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，第一测序接头连接步骤中，所述第一测序接头选自于Illumina测序平台的P7端测序接头、MGI测序平台的P1端测序接头中的任意一种。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一测序接头为双链测序接头，所述第一测序接头串联有可串联至模板分子的分子标签；

和/或，所述分子标签为随机核苷酸序列；

和/或，所述分子标签的长度为4-19bp；

和/或，所述第一测序接头包括互补配对连接的正向链、反向链，所述正向链的3’端修饰有封闭基团；

和/或，所述封闭基团选自磷酸基团、氨基C7、双脱氧胞嘧啶中的至少一种。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，解链步骤中，解链后，用链霉亲和素包被的磁珠结合第一引物单链延伸产物5’端的标记分子，并用磁力架将其收集于容器内壁，将反应体系的上清液转移至另一容器中，即为单链靶核苷酸分子，然后加入发夹式第二测序接头进行连接反应。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，第二测序接头连接步骤中，所述发夹式第二测序接头包括互补配对的正向链、反向链，所述正向链的3’端串联有随机核苷酸序列；

和/或，所述发夹式第二测序接头正向链的3’端串联的随机核苷酸序列长度为4-19nt；

和/或，所述第二测序接头选自Illumina测序平台的P5端测序接头、MGI测序平台的P2端测序接头中的任意一种；

和/或，发夹式第二测序接头连接步骤中，所采用的酶为DNA连接酶。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，解链步骤中，解链方法为热变性；

和/或，所述热变性处理具体是将目标分子加热到至少80℃保持至少1min。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二引物含有内接头序列、外接头序列，所述内接头序列的5’端串联连接至所述外接头序列的3’端，所述内接头序列可与所述第一测序接头反向互补配对连接，所述内接头序列、外接头序列之间串联有或未串联有第一样本标签；

和/或，所述第三引物含有内接头序列、外接头序列，所述内接头序列的5’端串联连接至所述外接头序列的3’端，所述内接头序列可与所述第二测序接头反向互补配对连接，所述内接头序列、外接头序列之间串联有第二样本标签；

和/或，所述第一样本标签、第二样本标签的长度独立地为4-19nt；

和/或，扩增结束后，进行纯化处理，得到文库；

和/或，所述纯化处理方法为磁珠法。