[发明专利]一种高纯度的同种异体NK细胞培养基以及体外扩增方法

说明书

本发明公开了一种高纯度的同种异体NK细胞培养基以及体外扩增方法。通过淋巴细胞分离液从胎盘血中分离单个核细胞，将分离的单个核细胞加入到含CD314抗体、IL‑2、灭活自体血浆等的无血清免疫细胞培养基体系中培养3天；培养第4天和第5天分别添加1次10％灭活自体血浆和1000IU/mL的IL‑2培养，继续培养7天后可见细胞大量扩增，继续培养2天，根据需要补充添加因子。本发明无需预先包被培养瓶，且无需用饲养层细胞，经过14‑16天培养，制备的NK细胞CD3‑CD16+/CD56+细胞表达率高达90％以上，且体外杀瘤活性强，能够解决现有NK培养体系和技术中，NK细胞纯度低、杀伤活性差的问题。

技术领域

本发明属于NK细胞培养技术领域，涉及一种高纯度的同种异体NK细胞培养基以及体外扩增方法。

背景技术

自然杀伤细胞(natural killer cell，NK细胞)是天然免疫系统里的重要成员，来源于骨髓淋巴样干细胞，主要分布于骨髓、外周血、肝、脾、肺和淋巴结，具有快速产生效应细胞因子和杀死病毒感染或肿瘤细胞的能力。NK细胞无需预先致敏就能非特异性杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞，其可通过快速激活一系列NK激活受体来识别和裂解肿瘤细胞。NK细胞起效快，且不需要肿瘤特异性识别，不受细胞表面的主要组织相容性复合体(MHC)抑制活性限制，具有广谱的抗肿瘤效应。因而，异体NK细胞在肿瘤过继性免疫治疗中发挥重要作用。但是，NK细胞在外周血中所占比例很低(5-15％)，因此在用于过继性免疫治疗之前，对NK细胞进行大量扩增十分必要。临床数据表明输注同种异体NK细胞同样具有安全性，没有任何毒副作用。NK细胞分布于外周血液、肝脏、脾脏、围产期组织(胎盘、脐带)等。相较成体外周血来源NK细胞相比，胎盘血来源NK具备更年轻、无后天污染、溶瘤能力和活性更强等优势，因而具有更有效的细胞免疫治疗潜能。

NK细胞的“动态平衡”主要受细胞表面多种受体蛋白的调控，包括NK细胞活化受体(KAR)和抑制受体(KIR)。NK细胞的活化状态，执行细胞的脱粒、细胞因子释放和细胞杀伤功能是抑制信号和活化信号综合的结果。NK细胞活化受体包括NKG2D(CD314)、CD16、NKp30(CD337)、NKp44(CD336)和NKp46(CD335)等。现有技术中有采用抗NKp46(CD335)和/或抗CD16用于NK细胞的体外增殖培养的活化激活。

然而，现有技术中存在以下问题：

⑴需要包被培养瓶，增加实验操作的复杂性；

⑵需要使用磁珠分选纯化的步骤，增加操作的难度及成本；

⑶现有技术较多使用灭活的K562细胞作为饲养层联合培养，存在一定的安全风险；

⑷现有NK细胞培养技术耗时长(最长达3周)，细胞纯度低；

⑸涉及胎盘血来源NK细胞培养扩增的技术较少。

发明内容

本发明公开了一种高纯度的同种异体NK细胞培养基以及体外扩增方法。能够解决现有NK培养体系和技术中，NK细胞纯度低、杀伤活性差的问题。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了一种高纯度的同种异体NK细胞培养基，包括基础培养基及其添加物，所述基础培养基为无血清免疫细胞培养基(包括但不限于LONZA X-VIVO培养基等)，所述添加物包括：抗CD314、抗CD16、注射用A群链球菌、自体血浆、IL-15、IL-2及IL-18。

优选地，所述无血清免疫细胞培养基在所述高纯度的同种异体NK细胞培养基中的体积百分数为90％。

优选地，各添加物在上述高纯度的同种异体NK细胞培养基中的占比为：