[发明专利]一种高纯度的同种异体NK细胞培养基以及体外扩增方法

权利要求书

1.一种具有杀伤活性的 NK 细胞的体外扩增方法，包括：

1） 通过淋巴细胞分离液从胎盘血中分离单个核细胞；

2） 将分离的单个核细胞加入到培养基 1 中培养 3 天，所述培养基 1 由体积

百分数为 90％基础培养基及添加物组成，所述基础培养基为无血清免疫细胞培

养基，所述添加物为 50ng/mL 抗 CD314、50ng/mL 抗 CD16、10E/mL 注射用 A

群链球菌、10% v/v 自体血浆、2000IU/mL 的 IL-15、2000IU/mL 的 IL-2、以及

1000 IU/mL 的 IL-18；

3） 培养第 4 天和 5 天，分别补充一次培养基 2 进行培养：如果细胞密度处

于 0.7～1.5×106 /mL，用培养基 2 将细胞密度调整至 0.7×106 /mL；如果细胞密

度大于 1.5×106 /mL，用培养基 2 将细胞密度调整至 1.0×106mL；所述培养基 2

含 90%体积的无血清免疫细胞培养基，10%体积的自体血浆和 1000 IU/mL 的 IL-2；

4） 继续培养 7 天后，当细胞密度≥1.5×106 /mL 时，补充添加有 IL-2 因子的

无血清免疫细胞培养基，稀释细胞至 0.7~2.0×106 /mL；所述添加有 IL-2 因子的

无血清免疫细胞培养基中 IL-2 因子的添加量为 1000~2000IU/mL；

5） 第 14 ~16 天收获细胞；

所述方法无需预先包被培养瓶，且无需用饲养层细胞。

2.根据权利要求 1 所述的具有杀伤活性的 NK 细胞的体外扩增方法，其特征在于，步骤 1）

包括：

1-1) 转移收集的胎盘血样至 T75 瓶，记录血样体积；

1-2) 另取 50mL 的离心管，用移液管在离心管底部分别加入 15mL 人淋巴细胞

分离液；

1-3) 在 15mL 人淋巴细胞分离液上，用移液管缓慢地加入 15~30mL 血样；

在水平转头离心机中离心，4℃，800g，20min；离心结束后，在不

扰动白膜层的情况下，吸出血浆层，转移至 50mL 离心管；

1-4) 将白膜层吸出，转移至另 50mL 离心管，加入 40mL PBS，吹打清洗，20℃，

400g，离心 10min，此步骤重复一遍；

1-5) 弃上清，加入 40mL PBS，吹打清洗，20℃，400g，离心 10min；

1-6) 将血浆管置于 56℃水浴锅内保持 30min 进行灭活，之后置于-20℃冰箱内20min 进行冷却；20℃，1500g，10min 离心后转移上清至 1 支新的离心管，标记“自体血

浆”，保存于 4℃。

3.根据权利要求 1 或 2 所述的具有杀伤活性的 NK 细胞的体外扩增方法，其特征在于，步骤 2）~步骤 5）中均在 37℃，5%CO2培养箱中静置培养。